我國(guó)天然纖維植物纖維素合酶基因研究進(jìn)展

黃欣智，姜雅軒，孫向前，付澤元，徐啟江

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150036)

21世紀(jì)以來(lái)，隨著以煤炭和石油為主的不可再生能源的不斷消耗，人類(lèi)逐漸將目光投向可再生能源。纖維素作為可再生能源的一種，年產(chǎn)高達(dá)幾億噸甚至更多，越來(lái)越受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注。纖維素由吡喃式D-葡萄糖為單體組成，由β-1，4-糖苷鍵連接，約有2 500個(gè)葡萄糖殘基。在植物體內(nèi)，纖維素的存在形式是微纖維。一般來(lái)說(shuō)，微纖絲是從36個(gè)β-1，4-葡萄糖苷鏈結(jié)晶的，它們貫穿每個(gè)細(xì)胞。微纖絲通過(guò)半纖絲連接，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可以幫助植物支撐和承受機(jī)械壓力[1]。纖維素也是植物細(xì)胞壁的最主要成分，從內(nèi)向外植物的細(xì)胞壁可以分為三部分，即次生壁(secondary cell wall，SCW)、初生壁(primary cell wall，PCW)和胞間層(intercellular layer)。次生壁是細(xì)胞成熟停止生長(zhǎng)之后合成的，細(xì)胞壁是木質(zhì)化的，堅(jiān)硬的，剛性的，機(jī)械性強(qiáng)的，對(duì)植物細(xì)胞具有很強(qiáng)的保護(hù)作用；初生壁是細(xì)胞生長(zhǎng)期合成的細(xì)胞壁，其特點(diǎn)是質(zhì)地柔軟，具有可塑性。半纖維素、果膠和木質(zhì)素是除纖維素外的植物細(xì)胞壁的組成成分。

植物的纖維是一種絮狀物，由植物的纖維素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成，主要在植物體內(nèi)起支撐、連接、包裹和充填的作用。天然植物纖維是指直接從植物中獲得的紡織纖維，植物來(lái)源可能是天然存在或人工培育。天然植物纖維是紡織工業(yè)的重要材料來(lái)源，目前，幾乎所有的天然纖維都來(lái)自棉花和各種麻類(lèi)作物。在我國(guó)，棉麻作物的種植歷史悠久，研究其纖維的合成對(duì)于提高棉麻纖維質(zhì)量、培育新品種具有重要的意義。綜述了近年來(lái)對(duì)纖維素合酶的研究特別是對(duì)天然植物纖維的CesA研究取得的進(jìn)展。

1 高等植物的纖維素合酶

高等植物纖維素合酶是由一種玫瑰狀或蓮花狀的纖維素合酶復(fù)合體(Cellulosesynthasecomplex，CSC)合成的，這種酶定位在細(xì)胞膜之上，含有六個(gè)大亞基，每個(gè)亞基含有至少3種纖維素合成酶(Cellulosesynthase，CesA)蛋白，形成一個(gè)36單體復(fù)合體[2]，有人用復(fù)合的復(fù)合物(complex complex)來(lái)形容它。CSC中含有大量蛋白質(zhì)，包括CesA蛋白，CSL(類(lèi)纖維素合酶)蛋白，UDPG(UDP-葡萄糖)形成相關(guān)的蛋白，纖維素內(nèi)切酶(KORRIGAN)，細(xì)胞骨架蛋白(微管蛋白和肌動(dòng)蛋白)等[3]，其中CesA蛋白作為重要組成部分，是復(fù)合物的催化亞基[4]。纖維素合成酶最初是從人類(lèi)的細(xì)菌中鑒定出來(lái)的[5-6]。1995年，Saxena和Brown在醋酸桿菌(Acetobacterxylinum)中鑒定出了細(xì)菌的纖維素合酶[7]，他將細(xì)菌纖維素合成酶作為鑒定植物的纖維素合成酶的工具。后來(lái)，人們從許多植物中鑒定出CesA，包括擬南芥[8]、棉花[9]、玉米[10-11]等。研究表明：即使在同一植株的不同位置，不同的CesA基因也有不同的表達(dá)，因?yàn)?個(gè)CesA蛋白可以組裝成1個(gè)亞基，3個(gè)CesA蛋白之間可以不同，也可以相同。以擬南芥為例，人們?cè)跀M南芥中共鑒定出10種CesA基因，發(fā)現(xiàn)AtCesA1、AtCesA2、AtCesA4、AtCesA5、AtCesA6、AtCesA9和細(xì)胞初生壁表達(dá)有關(guān)，AtCesA4、AtCesA8、AtCesA9與擬南芥細(xì)胞壁次生壁的合成密切關(guān)聯(lián)，而AtCesA10表達(dá)具有強(qiáng)烈的組織特異性，只在角果后期和種子形成初期強(qiáng)烈表達(dá)[12]。

通過(guò)對(duì)小麥的研究，人們發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)論：小麥的CesA1、CesA2、CesA4、CesA5、CesA6、CesA9和細(xì)胞初生壁表達(dá)有關(guān)，而CesA4、CesA8、CesA9參與次生壁表達(dá)[13]。CesA基因的突變會(huì)導(dǎo)致植物纖維素合成受阻。研究表明，水稻bc6突變體(OSCesA9基因半顯性突變體，在該基因的高度保守區(qū)發(fā)生錯(cuò)義突變)植株中，莖稈的纖維素含量減少了38%[14]。CesA基因的長(zhǎng)度大多介于3.5～5.5 Kb，一般有9～13個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子的多少和基因的結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。CesA基因編約1 000個(gè)氨基酸的肽鏈，一般介于988～1 088。它們之間的一致性為 53%～98%[15]。1995年，Delmer為纖維素合成酶基因的命名制訂了規(guī)則：纖維素合成酶(cellulosesynthase)由Ces表示，種屬名置于其在前面，基因后面的“A(B)”表明它編碼細(xì)菌催化亞基的同源體，此后這種規(guī)則在命名此類(lèi)基因是得到了沿用[16]。例如：AtCesA表示擬南芥纖維素合成酶(idopsisthalianacellulosesynthase)。目前的植物纖維素生物合成模型分為三部分：其一，在蔗糖合酶作用下，UDP-葡萄糖提供底物；其二，由不同的CesA組成的CesA蛋白組裝形成玫瑰狀的CSC復(fù)合物，該復(fù)合體聚合葡萄糖單體形成鏈，同時(shí)UDP釋放后被回收，并返回至蔗糖合酶繼續(xù)作為纖維素合成的底物；其三，纖維素酶KORRIGAN (Kor)對(duì)有缺陷的葡聚糖鏈進(jìn)行切割，催化其轉(zhuǎn)換為纖維素微纖絲[17]。

2 纖維素微纖絲合成其他有關(guān)蛋白

除了CesA蛋白之外，還存在一類(lèi)類(lèi)纖維素合成酶蛋白(cellulosesynthase-like,Csl)，也是糖基轉(zhuǎn)移酶家族的一員，在 β-1，4- 甘露糖苷和 β-1，4- 葡萄糖苷鍵以及葡甘聚糖骨架合成過(guò)程中起著重要作用。Csl家族包括CslA/B/C/D/E/F/G/H/J 亞家族[18-19]。研究表明：花粉管發(fā)育需要CSLD1和CSDL4，CSLD2，這是正常根毛形成所需的。當(dāng)CsLD出現(xiàn)突變，會(huì)對(duì)花粉管壁纖維素的沉積產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[20-21]。

3 我國(guó)麻類(lèi)作物CesA的研究進(jìn)展

2006年，田志堅(jiān)[22]利用擬南芥纖維素合成酶AtCesA7保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，后續(xù)用RACE法克隆該基因，首次從苧麻中分離得到一個(gè)3276 bp的片段，利用BLAST在線分析軟件對(duì)片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該片段和已知的擬南芥、玉米、馬鈴薯等植物CesA有很高的同源性，但是缺少5’端的部分序列，說(shuō)明他成功克隆到了缺少5’部分序列的BnCesA基因，并因?yàn)樵摶蚝蛿M南芥AtCesA1同源程度較高，故命名為BnCesA1。同時(shí)，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)苧麻的不同部位進(jìn)行半定量檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該基因在莖葉芽根4個(gè)部位都有表達(dá)，含量大小依次減小。在次生生長(zhǎng)的莖和初生生長(zhǎng)的芽中的表達(dá)表明，該基因在PSW,RSW中都表達(dá)，從而證實(shí)該基因表達(dá)不具有特異性。田志堅(jiān)，易容[22-24]等人構(gòu)建了BnCesA1反義表達(dá)載體，并將其用于煙草轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移到BnCesA1的煙草和正常煙草相比，有明顯間隙出現(xiàn)在葉柄橫截面基本組織細(xì)胞間，細(xì)胞之間連接變得松散，細(xì)胞膨大。因此推測(cè)出是導(dǎo)入BnCesA1反義表達(dá)載體的煙草細(xì)胞壁合成受到抑制，導(dǎo)致纖維素含量出現(xiàn)下滑。之后，蔣杰[25]、劉昱翔[26]等人陸續(xù)克隆了BnCesA1、BnCesA2、BnCesA3、BnCesA4、BnCesA5、BnCesA6、BnCesA7(部分)。分析這些基因長(zhǎng)度為3 120～3 270 bp，具有CesA蛋白的特征結(jié)構(gòu)域，在進(jìn)化上類(lèi)似于玉米、棉花、擬南芥CesA結(jié)構(gòu)。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR(qrt-PCR)技術(shù)對(duì)4個(gè)不同苧麻品種的4個(gè)BnCesA2、BnCesA3、BnCesA4、BnCesA5基因進(jìn)行木質(zhì)部和韌皮部表達(dá)分析，結(jié)果表明：這4個(gè)基因在木質(zhì)部和韌皮部的表達(dá)不存在特異性和規(guī)律性。在整個(gè)BnCesA2、BnCesA4中，4個(gè)品種的表達(dá)含量明顯高于BnCesA3、BnCesA5，這在一定程度上表明前者在苧麻纖維素合成過(guò)程中可能具有更重要的作用。

亞麻是自花授粉植物，基因組和植株都較小。目前，亞麻是研究纖維素合酶的較理想模型。高原[27-28]成功克隆到了6個(gè)LusiCesA片段(LusiCesA1、LusiCesA2、LusiCesA3、LusiCesA4、LusiCesA5、LusiCesA6)和5個(gè)LusiCSLD基因片段(LusiCSLD1、LusiCSLD2、LusiCSLD3、LusiCSLD4、LusiCSLD5)。通過(guò)BLAST分析發(fā)現(xiàn)，這些基因和楊樹(shù)、擬南芥、玉米等植物的相似性在80%以上。吳建忠[29]在已報(bào)道部分序列文獻(xiàn)[30]的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性的引物，高保真PCR，最后測(cè)序后得到了亞麻L(zhǎng)usiCesA1基因的全長(zhǎng)序列，該基因序列長(zhǎng)3 225 bp，利用交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)驗(yàn)證了這一結(jié)果，確定片段為L(zhǎng)usiCesA1全長(zhǎng)。于瑩等[31]克隆了亞麻纖維素合成酶LusiCesA8，在對(duì)其進(jìn)行序列分析后，開(kāi)放讀碼框全長(zhǎng)2 967 bp，共編碼988個(gè)氨基酸。通過(guò)BLAST比較，該基因與麻風(fēng)樹(shù)、胡楊等植物的CesA8同源性較高，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)對(duì)兩種不同的亞麻CesA8進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果表明，兩種物種之間的基因表達(dá)模式具有很高的一致性。基因的表達(dá)在幼苗期(BBCH19)到快速生長(zhǎng)期(BBCH32)由較低狀態(tài)升至頂峰，過(guò)渡到現(xiàn)蕾期時(shí)該基因的表達(dá)量又出現(xiàn)下降，至花期(BBCH65)恢復(fù)，并又一次到達(dá)了峰值。出現(xiàn)蒴果之后表達(dá)含量開(kāi)始下降，但隨蒴果數(shù)量增加，該基因表達(dá)量逐漸增加。吳建忠[32]利用基因敲除獲得亞麻L(zhǎng)usiCesA1 缺失突變體，成功構(gòu)建了SSH抑制消減文庫(kù)，通過(guò)抑制差減雜交，構(gòu)建了亞麻纖維素合酶CesA1基因的cDNA文庫(kù)，之后進(jìn)行逆向斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，發(fā)現(xiàn)了有122個(gè)基因表達(dá)存在差異，其中27個(gè)未知，95個(gè)則是已知基因的同源克隆。推測(cè)發(fā)覺(jué)這些基因中可能對(duì)該基因上調(diào)表達(dá)的基因功能克隆以三類(lèi)為主：影響代謝途徑、改變蛋白質(zhì)命運(yùn)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，共計(jì)約占30%。袁紅梅等人[33]利用Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)的亞麻基因組共鑒定了 45 個(gè)亞麻CesA/Csls家族基因成員，它們分屬于兩類(lèi)，7 組，在 scaffolds 上分布，基因結(jié)構(gòu)和蛋白基序在組間具有多樣性，在組內(nèi)具有保守性。在不同發(fā)育階段，各種不同的基因存在著一定的時(shí)空特異性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CesA/Csls中的一些基因可以對(duì)于激素 BR、Brz 及NaCl 脅迫產(chǎn)生一定響應(yīng)。江海霞[34]等人研究了亞麻快速生長(zhǎng)期莖纖維CesA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)快速生長(zhǎng)期亞麻莖韌皮纖維細(xì)胞壁沒(méi)有次生加厚過(guò)程。在亞麻細(xì)胞壁伸長(zhǎng)過(guò)程中，有LusiCESA1、LusiCESA3、LusiCESA9和LusiCESA10基因的參與。

4 棉花纖維素合酶CesA研究進(jìn)展

1996年，pear從陸地棉中鑒定出了兩個(gè)CesA基因，這是人類(lèi)首次從高等植物中鑒定出的纖維素合酶基因[35]。王如意克隆了GhCesA6和GhCesA7，發(fā)現(xiàn)GhCesA6在棉纖維整個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量都很高，說(shuō)明該基因在棉纖維初生壁的合成中起重要作用，GhCesA7在次生壁中大量表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GhCesAs的表達(dá)含量會(huì)在對(duì)提取的棉細(xì)胞膜蛋白加入纖維素酶后出現(xiàn)提升，加速纖維素的體外合成[36]。范建克隆了GhCesA5、GhCesA8、GhCesA10，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和抗體制備。他在對(duì)CesA復(fù)合體鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，除了有已經(jīng)報(bào)道過(guò)的CesA家族、SuSy家族及細(xì)胞骨架蛋白(actin等)，還有纖維素內(nèi)切酶，但目前并沒(méi)有證據(jù)證明該酶是CesA復(fù)合體的一部分，這可能為解析纖維素合酶的功能提出了一個(gè)新的方向[37]。通過(guò)Western bloting發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)棉纖維的發(fā)育時(shí)期，GhCesA5和GhCesA10都有很高的表達(dá)量，是典型的初生壁纖維素合酶基因；GhCesA8在初生細(xì)胞壁形成時(shí)期不表達(dá)，但是進(jìn)入次生細(xì)胞壁合成時(shí)期，表達(dá)含量突然急劇增加，說(shuō)明它是次生細(xì)胞壁合成基因[38]。李先良在次生生長(zhǎng)旺盛的棉纖維細(xì)胞中鑒定出了兩種CesA：初生細(xì)胞壁合成的和次生細(xì)胞壁合成的CesA，這種結(jié)果和擬南芥研究中發(fā)現(xiàn)的一致，推測(cè)出CesA可能形成兩種不同類(lèi)型復(fù)合體，初生壁合成復(fù)合體和次生壁合成復(fù)合體。CesA及復(fù)合體在初生壁和次生壁中的不同可能是導(dǎo)致棉花初生次生纖維聚合度不同的原因[39-40]。

5 展望

細(xì)胞壁是植物細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)，在植物結(jié)構(gòu)組成中起著重要作用。細(xì)胞中也存在著一種次生增厚的現(xiàn)象，如厚壁細(xì)胞、纖維細(xì)胞、管狀導(dǎo)管等。細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，次生加厚的主要物質(zhì)是木質(zhì)素，為次生加厚的細(xì)胞提供了保護(hù)和抵抗損傷及病原體的能力。植物纖維素合成機(jī)制一直是研究人員關(guān)注的問(wèn)題。纖維素的合成調(diào)節(jié)涉及多個(gè)方面，包括CesA蛋白的表達(dá)、調(diào)控、修飾和分泌，胞質(zhì)中CSC復(fù)合體的裝配，纖維素的合成與沉積[33]。在棉花和麻類(lèi)植物中，人類(lèi)能利用的最重要的是其天然纖維。對(duì)這些植物的纖維素的研究可以幫助人類(lèi)提高其纖維質(zhì)量，從而進(jìn)一步培育出纖維性能更好、纖維產(chǎn)量更高的優(yōu)良品種。20多年來(lái)，纖維素合成酶的研究取得了很大進(jìn)展，然而對(duì)于天然纖維植物的纖維素合成酶的研究才剛剛開(kāi)始，許多基因尚未得到深入研究，特別是類(lèi)纖維素合成酶CSL蛋白，目前其功能和分子生物學(xué)機(jī)制還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究。

對(duì)于麻類(lèi)作物的纖維素合酶研究，不僅可以通過(guò)對(duì)纖維素合酶基因進(jìn)行研究，還可以從分子生物學(xué)的手段入手，通過(guò)CRISPER、RNAi、miRNA、轉(zhuǎn)錄組等分子生物學(xué)手段進(jìn)行研究。例如：在亞麻莖的激光顯微解剖采集樣本，發(fā)現(xiàn)了在韌皮部纖維侵入性伸長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)差異的miRNA及其靶基因，如miR396s。該基因家族和它們的靶點(diǎn)(如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子)與更晚發(fā)育的纖維和不同細(xì)胞類(lèi)型的纖維相比，miR396家族的幾個(gè)成員在侵入性纖維伸長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)了下調(diào)，這表明miR396家族的表達(dá)具有組織特異性和階段特異性，說(shuō)明miR396、AGO7和miR390等復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)可能在侵入性延伸過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，這種現(xiàn)象可能和植物的激素調(diào)節(jié)有關(guān)，如miR160，就和生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)有關(guān)[41]。還有研究表明，在亞麻中發(fā)現(xiàn)了大量的保守植物miRNA，其可能在亞麻的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，這就給亞麻纖維的生長(zhǎng)研究提供了新的思路[42]。

研究表明，磷酸化或s-酰化等翻譯后修飾調(diào)控纖維素的合成，且一些蛋白因子參與了纖維素合成的調(diào)控，如金屬硫蛋白[43]，在其他植物中已經(jīng)證明了金屬硫蛋白在其中的作用。富含纖維素的植物細(xì)胞類(lèi)型金屬硫蛋白(metallothionein)通過(guò)向GhCESA蛋白的鋅結(jié)合域提供鋅離子，參與了CESA復(fù)合物的形成調(diào)控[44]，這同樣為這些種子纖維植物的纖維素合酶研究提供了另一個(gè)思路：這些蛋白因子是如何和怎樣和其纖維素合酶作用，從而達(dá)到調(diào)控表達(dá)效果。

以亞麻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究其14個(gè)CesA基因的在不同部位和不同生長(zhǎng)時(shí)期的差異表達(dá)情況取得了一定的進(jìn)展，待找出差異表達(dá)基因之后，就可以運(yùn)用基因敲除等手段，解析不同CesA基因在亞麻中的表達(dá)情況和作用，為培育出含有更優(yōu)質(zhì)纖維的亞麻提供理論基礎(chǔ)。