潿洲島珊瑚礁海洋真菌的分離鑒定及其抗MRSA活性篩選*

盧護木，詹振宇，李 蜜，羅雙宇，高程海，羅小衛，劉永宏

(廣西中醫藥大學海洋藥物研究院，廣西南寧 530200)

0 引言

抗生素耐藥性是全球范圍內普遍存在的公共衛生問題，臨床上β-內酰胺類、大環內酯類和氨基糖苷類等抗生素的耐藥性問題日益嚴重，隨著多重耐藥“超級細菌”的出現，抗生素耐藥性問題受到廣泛關注[1-3]。耐甲氧西林金黃色葡菌球菌(MRSA)自1961年在英國首次被發現以來，以驚人的速度在世界范圍內蔓延。目前，MRSA是引起醫院感染的重要病原菌之一，對臨床多種抗生素產生嚴重的耐藥性，其感染人數已超過艾滋病、結核病和病毒性肝炎患病人數,是患者延長住院時間和增加醫療費用的重要原因[4-6]。中國是抗生素生產和使用大國，由抗生素濫用導致因耐藥菌感染而引起的臨床死亡病例日益增多，挖掘新型抗生素迫在眉睫[7]。海洋占地球表面積的71%，具有廣袤的地理空間及特殊的生態環境，孕育著豐富的特色海洋生物資源。作為海洋生物的重要組成部分，海洋微生物長期棲息在高壓、高鹽、高pH值等特殊生態環境，具有獨特的生理代謝機制[8]，是新穎復雜活性天然產物的重要來源[9]，為新型抗生素的發現提供化學實體[10]。

海洋真菌是海洋微生物的重要組成部分，其來源廣泛，可以從海洋動植物(含紅樹林)、海水及海洋沉積物等載體中分離得到，是近年來海洋天然產物研究的熱點[11]。海洋真菌次級代謝產物具有化學多樣性，包括生物堿、多肽、聚酮、萜類、甾體等[12]，是抗腫瘤、抗感染等活性分子的重要來源[13,14]。

廣西北部灣地處熱帶與亞熱帶地區，其中潿洲島珊瑚礁區孕育著豐富獨特的海洋生物資源。這些豐富多樣的海洋生物共附生微生物與宿主在長期進化過程中產生化學防御物質，而這些化學防御物質往往具有新穎復雜的化學結構及廣譜顯著的生物活性。雖然廣西潿洲島珊瑚礁區海洋微生物資源豐富，但是關于其海洋微生物活性天然產物的研究起步較晚[15]。基于此，本研究從廣西潿洲島珊瑚礁區采集珊瑚、海綿和海藻等北部灣特色海洋生物樣品，利用稀釋分離法從其新鮮組織中初步分離純化菌株，采用現代譜學分析技術及抗MRSA活性進一步篩選，從而得到代謝產物豐富且具潛在抗菌活性的菌株，為發現海洋真菌來源新型抗生素奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

EYELAN-1001型旋轉蒸發儀(上海愛郎儀器有限公司)，SHZ-CB型循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)，KQ-250DB 型超聲儀(鞏義市予華儀器有限公司)，立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(合肥華泰醫療器械有限公司)，薄層硅膠板(煙臺江友硅膠開發有限公司)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫公司)，Applied Biosystems PCR儀(賽默飛世爾科技公司)，麥芽提取粉(廣東環凱微生物科技有限公司)。海鹽(廣州海利水產有限公司)，提取分析所用試劑乙酸乙酯、甲醇等均為化學純(廣州化學試劑廠)，液相色譜用乙腈和甲醇均為色譜純(美國Merck公司)。

1.1.2 培養基

真菌分離MB培養基：麥芽提取粉15 g，瓊脂粉15 g，海鹽10 g，氯霉素0.2 g，蒸餾水1 L，調節pH值為7.4-7.8，于121℃下高壓蒸汽滅菌30 min，待溫度降至60℃左右，于超凈工作臺倒平板，冷卻后待用。

MB液體培養基：麥芽提取粉1.5 g，海鹽2 g，蒸餾水100 mL，調節pH值為7.4-7.8，用橡膠塞封口，于121℃下高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后待用。

大米培養基：大米50 g，海鹽1.5 g，蒸餾水75 mL，于121℃下高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后待用。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉18 g，海鹽10 g，蒸餾水1 L，調節pH值為7.4-7.8，于121℃下高壓蒸汽滅菌30 min，待溫度降至60℃左右，于超凈工作臺倒平板，冷卻后待用。

1.2 方法

1.2.1 海洋真菌的分離鑒定

采集廣西潿洲島珊瑚礁區的葉狀薔薇珊瑚(Montiporafoliosa)、伴綿藻(Ceratodictyonspongiosum)和巢沙菜(Hypneapannosa)等海洋生物樣品(圖1)。將上述海洋生物新鮮組織用清水洗凈并剪斷成長度為2—3 mm的碎片，用無菌水漂洗3次后，分別置于盛有無菌海水的125 mL三角瓶中，在搖床上振蕩10 min (120 r/min)，即成備用菌懸液，然后用無菌水依次稀釋，取合適梯度濃度的菌懸液涂布于MB平板上，每個稀釋度重復3次，置于26-28℃恒溫箱中培養3 d，待菌落長出后，挑取形態、色澤、大小不同的單菌落在MB平板上重新培養純化。

采用分子生物學鑒定技術[16]，根據內轉錄間隔區(ITS)序列和系統發育樹分析對部分菌株進行鑒定。用無菌牙簽挑取少量真菌菌絲體，置于1.5 mL離心管中，微波法提取真菌基因組DNA[17]。采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-G-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增分離菌株的rDNA ITS區。PCR反應體系 (25 μL)如下：模板DNA 1 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，Premix Taq引物酶12.5 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR擴增程序如下：94℃ 3 min；94℃ 50 s，52℃ 1 min，72℃ 50 s，35個循環；72℃ 10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，基因測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。測序結果在GenBank數據庫中進行BLAST分析，檢索相似性序列，初步鑒定菌株的種屬。

圖1 潿洲島珊瑚礁區采集的珊瑚、海綿和海藻樣品

1.2.2 海洋真菌的小量發酵及提取濃縮

對分離得到的單一菌株采用大米培養基進行小量發酵。同時，利用500 mL錐形瓶準備MB液體培養基，滅菌后，將菌株接種至該培養基中，然后于28℃、180 r/min條件下培養2 d，即為種子液。在超凈工作臺中將種子液接種至已滅菌的大米固體培養基中(4%接種量)，于室溫靜止發酵30 d。觀察菌株生長狀態，發酵結束后向大米培養基發酵產物中加入等體積乙酸乙酯，搗碎，超聲提取20 min。減壓過濾后，利用旋轉蒸發儀濃縮濾液，濾渣繼續用乙酸乙酯反復提取，至濾液顏色變淺，然后濃縮合并濾液獲得菌株粗提物。

1.2.3 菌體提取物的色譜分析

將菌株粗提物用甲醇溶解配成1 mg/mL的溶液，以毛細玻璃管吸取5-10 μL，點于硅膠G254薄層板上，揮干甲醇，分別采用二氯甲烷-甲醇(V/V，20∶1)和石油醚-乙酸乙酯(V/V，8∶1)作為展開劑進行展開，置于紫外光燈(254 nm)下以及碘缸中顯色觀察。使用0.22 μm濾膜過濾1 mg/mL菌株粗提物溶液，然后采用HPLC-DAD指紋圖譜分析。色譜條件為色譜柱：YMC-Pack ODS-A,250×4.6 mm LD.,S-5 μm,12 nm；流動相：乙腈(95%-100%)/純水，梯度洗脫60 min；檢測波長：200-500 nm；柱溫：35℃；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；采用二極管陣列檢測器(DAD)檢測。

1.2.4 菌株提取物的MRSA抑制活性測試

采用濾紙片瓊脂擴散法篩選抑菌活性化合物[18]，將待測菌株粗提物配成濃度為0.10 mg/mL的甲醇溶液，陽性對照氨芐西林配成0.64 mg/mL的甲醇溶液，甲醇溶液作為陰性對照。分別用移液槍吸取10 μL待測樣品溶液于直徑為6 mm的無菌濾紙片上，待甲醇揮干后，將載樣濾紙片貼于已涂布 100 μL×106CFU/mL MRSA菌懸液的LB培養基上，25℃條件下倒置培養24 h，每隔12 h觀察是否產生抑菌圈。以ds≥1/2dp(ds：粗提物樣品的抑菌圈直徑，dp：陽性藥的抑菌圈直徑)的粗提物樣品對應的菌株為具有抗菌活性的菌株。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

采用稀釋分離法從潿洲島珊瑚礁區海洋生物中共分離得到40株真菌，其中從葉狀薔薇珊瑚中分離出10株(MF01—MF10)，從巢沙菜中分離出22株(HP01—HP22)，從伴綿藻中分離出8株(CS01-CS08)。通過分子生物學技術對代謝產物豐富、活性較好的部分潛力菌株進行物種鑒定(表1)，發現這些菌株主要為曲霉屬Aspergillus(占鑒定菌株中38.1%)和木霉屬Trichoderma(占鑒定菌株中23.8%)。

表1 部分菌株的物種鑒定

續表1

2.2 色譜分析結果

薄層色譜(TLC)分析發現，菌株MF01、MF03、MF06、HP08、HP13、HP17、CS02的大米培養基發酵產物顯色斑點較多，說明其代謝產物豐富(圖2)。高效液相色譜(HPLC-DAD)分析結果表明不同菌株提取物的譜學特征具有顯著差異，其中菌株 MF01、MF03、MF07、HP01、HP04、HP08、HP16、HP17、HP22、CS02的大米培養基發酵產物中代謝產物較為豐富(圖3)。以上TLC和HPLC-DAD分析結果基本一致。

D：二氯甲烷Dichloromethane；M：甲醇Methanol；P：石油醚Petroleum ether；E：乙酸乙酯Ethyl acetate

圖3 菌株MF01、MF07、HP01和HP08大米培養基發酵產物的HPLC-DAD指紋圖譜

2.3 抗菌活性篩選結果

基于濾紙片瓊脂擴散法對40株真菌的大米培養基發酵產物進行抗MRSA活性初步篩選，結果顯示菌株MF01、MF07、HP01、HP07、HP08、HP17和HP20的大米培養基發酵產物具有一定的抗MRSA活性(表2和圖4)。

表2 菌株大米培養基發酵產物的MRSA抑制活性

3 結論

本研究采用稀釋分離法從廣西潿洲島珊瑚礁區葉狀薔薇珊瑚、伴綿藻和巢沙菜的新鮮組織中，分離純化獲得40株真菌，其中巢沙菜的共附生真菌最為豐富。基于分子生物學鑒定方法對菌株進行物種鑒定，發現這些真菌以曲霉屬和木霉屬為主。綜合運用薄層層析色譜和HPLC-DAD分析菌株大米培養基發酵產物中的化學多樣性，并結合基于濾紙片瓊脂擴散法的MRSA抑制活性初步篩選研究發現,菌株A.terreusMF01、A.flavusMF07、T.asperellumHP01、F.equisetiHP08和A.unguisHP17不僅具有豐富多樣的次生代謝產物，還具有顯著的MRSA抑制活性，后續將開展活性代謝產物的發掘研究，為發現新型抗MRSA活性分子奠定理論基礎。

圖4 菌株大米培養基發酵產物的MRSA抑制活性