促甲狀腺激素受體調(diào)控動物季節(jié)性繁殖的研究進展

夏 青 張仁森 李華振 王鳳艷 王翔宇 魏彩虹 賀小云 儲明星 狄 冉

(中國農(nóng)業(yè)科學院 北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193)

最初，促甲狀腺激素受體(Thyroid-stimulating hormone receptor，TSHR)在狗甲狀腺組織中發(fā)現(xiàn)，且在很長一段時間里研究者們認為TSHR基因只在動物甲狀腺組織中表達。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TSHR基因在動物多個組織廣泛表達，并且甲狀腺和胸腺TSHR主要參與人類格雷夫斯病(Graves’ disease, GD)發(fā)病機制調(diào)控[1-3]。近年來，國內(nèi)外許多學者研究發(fā)現(xiàn)下丘腦TSHR基因與動物季節(jié)性繁殖行為具有較強的相關性[4-10]。下丘腦TSHR與促甲狀腺激素β亞基(Thyrotrophin β subunit, TSHβ)結合間接刺激甲狀腺激素(Thyroid hormone，TH)分泌，刺激下丘腦-垂體-性腺軸，以此調(diào)控季節(jié)性繁殖活動[11]。卵巢TSHR還可調(diào)控卵泡顆粒細胞增殖[12]。因此，TSHR是動物季節(jié)性繁殖的重要調(diào)控基因之一。本文根據(jù)實驗室前期的試驗結果，發(fā)現(xiàn)TSHR基因在綿羊中受到強烈選擇。因此，本文就TSHR的基本特征尤其是它對動物季節(jié)性繁殖和卵巢功能的調(diào)控最新研究情況進行闡述，為更好更深入的研究TSHR基因提供理論基礎。

1 TSHR的基本特征

1.1 TSHR基因及其表達蛋白結構

TSHR基因及其編碼的蛋白在動物中具有高度保守性。不同動物TSHR基因位于不同染色體。例如綿羊位于7號染色體，雞位于5號染色體，人位于14號染色體，但絕大部分物種TSHR基因具有10個外顯子[8,13-14]。哺乳動物(人、綿羊和大鼠)及非哺乳動物(鵝、雞)TSHR基因均編碼約760個氨基酸的跨膜蛋白。TSHR蛋白屬于糖蛋白激素受體亞家族[6,15-16]，具有7個跨膜結構，膜外結構與膜內(nèi)結構各自形成3個環(huán)，分為膜外、跨膜和膜內(nèi)區(qū)3個部分。TSHR胞外區(qū)主要由11個亮氨酸富集重復序列(Leucinerich repeat，LRRs)組成[17]。胞外區(qū)結構有多個TSH結合位點，也包含了TSHR自身抗體的主要結合位點[18]。TSHR的主要功能是與TSH結合，活化G蛋白-腺苷酸環(huán)化酶-cAMP和磷脂酶信號系統(tǒng)，激活G蛋白耦聯(lián)，引發(fā)細胞內(nèi)級聯(lián)反應，促進甲狀腺激素的合成、分泌和甲狀腺細胞的生長，是脊椎動物垂體-甲狀腺軸的重要組成部分[19]。

1.2 TSHR在動物體內(nèi)的表達

TSHR基因最初從犬甲狀腺中克隆得到[20]。起初，研究者認為TSHR僅在甲狀腺中表達，隨著研究不斷深入，在越來越多非甲狀腺組織中發(fā)現(xiàn)TSHR表達。例如，在小鼠眼眶后組織、下丘腦、垂體、淋巴細胞、棕色脂肪組織和紅細胞中發(fā)現(xiàn)TSHR存在[21]。人垂體前葉細胞、十二指腸成纖維細胞、骨細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞和星形膠質(zhì)細胞中也有TSHR的表達[22]。動物腦部TSHR的表達主要集中在下丘腦室管膜細胞(Ependymal cell, EC)和垂體結節(jié)部(Pars tuberalis, PT)區(qū)域[23]。Hazlerigg等[24]發(fā)現(xiàn)綿羊下丘腦正中隆起、室管膜室旁核、第三腦室、垂體、子宮和卵巢等組織均有TSHR表達。

對歐洲黑鱸的研究顯示，TSHR表達在黑鱸卵子和精子復生過程中呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性變化，TSHR參與雌性黑鱸卵黃生成以及調(diào)節(jié)配子成熟和排卵；對雄性黑鱸而言，TSHR可能涉及早期性腺發(fā)育的調(diào)節(jié)以及配子成熟和排精過程[25]。另外，哺乳動物卵巢中也存在TSHR的表達，這種TSHR在卵巢上的表達可能與調(diào)節(jié)卵巢的功能有關。例如，雌性兔生殖器官中廣泛存在TSHR[26-27]。牛成熟黃體中存在TSHR蛋白，推測它參與孕激素合成的局部調(diào)節(jié)[28]。TSHR在大鼠卵巢中也發(fā)揮作用，且大鼠顆粒細胞TSHR存在高表達[29]。人TSHR在卵巢表皮以及原始、初級和次級卵泡中高表達，用TSH刺激顆粒細胞，培養(yǎng)2 h發(fā)現(xiàn)cAMP濃度顯著增加，表明cAMP濃度受TSHR激活調(diào)控。這些數(shù)據(jù)表明TSHR可能對卵巢有調(diào)節(jié)功能，TSHR信號轉(zhuǎn)導的失調(diào)可能導致卵巢腫瘤發(fā)生[12,30]。有研究報道發(fā)現(xiàn)TSHR在各種硬骨魚性腺中發(fā)揮作用[25,31]。這些數(shù)據(jù)表明TSHR對卵巢發(fā)育和動物的繁殖有調(diào)節(jié)功能。

2 TSHR對卵巢功能的調(diào)控

目前，關于TSHR基因?qū)β殉沧饔脵C制的研究多集中在大鼠和人上。大鼠垂體分泌的促性腺激素(促黃體素(Luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH))作用于卵巢，LH和FSH可驅(qū)動cAMP級聯(lián)反應上調(diào)TSHR表達，卵巢分泌高濃度的雌二醇(β-Estradiol，E2)抑制TSHR表達[28]。大鼠卵母細胞分泌甲狀腺刺激素(Thyrostimulin)作用于卵泡顆粒細胞，卵泡顆粒細胞表達的TSHR接受甲狀腺刺激蛋白信號，并與相關Gα蛋白(例如Gαs)相互作用，刺激腺苷酸環(huán)化酶(AC)開啟cAMP依賴性途徑。研究發(fā)現(xiàn)上述途徑在人卵巢通過復雜的串聯(lián)通路，激活環(huán)狀AMP反應元件結合蛋白(Cyclic AMP-responsive element binding protein, CREBP)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)和AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase,AKT)通路，導致上述3種蛋白質(zhì)磷酸化水平增加[12]。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)抑制劑可有效消除AKT和ERK的磷酸化，并促進甲狀腺刺激蛋白引起的細胞增殖，提示上述通路對顆粒細胞增殖具有促進作用。cAMP和蛋白激酶A(Protein kinase A, PKA)結合激活PKA，可刺激編碼P450芳香化酶和LHR轉(zhuǎn)錄，同時激活有絲分裂和卵泡液形成，使顆粒細胞中LHR和FSHR表達增加[12, 29]。

在兔卵巢表面上皮以及原始、初級和次級卵母細胞中觀察到了TSHR、TRα1和TRβ1強免疫染色，而次級卵泡顆粒細胞中染色最弱。竇狀卵泡顆粒細胞表達TSHR、TRα1和TRβ1蛋白[32-33]。Wakim等[34]發(fā)現(xiàn)人黃素化顆粒細胞含有高親和力的甲狀腺激素結合位點。卵巢外組織分泌的甲狀腺激素可作用于卵巢表面及顆粒細胞的甲狀腺激素受體，參與卵巢表面上皮的激素調(diào)節(jié)。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)人成熟卵母細胞含有TRα和TRβ，卵泡液中存在DIO2、DIO3、T3和T4。這表明卵巢中存在DIO2與DIO3相互轉(zhuǎn)化并刺激T3和T4相互轉(zhuǎn)化的作用機制，同時T3可能直接作用于卵母細胞[33-36]。綜上所述，TSHR對卵巢調(diào)控機制如圖1所示。

圖1 TSHR對卵巢功能的調(diào)控[12,27]

3 TSHR對動物季節(jié)性繁殖的調(diào)控

3.1 TSHR對綿羊季節(jié)性繁殖的調(diào)控

下丘腦的TSHR參與調(diào)節(jié)鳥類和哺乳動物的季節(jié)性繁殖[37-38]。下丘腦室管膜細胞(Ependymal cell, EC)連通垂體門脈系統(tǒng)和第三腦室腦脊液(Cerebrospinal fluid，CSF)，與下丘腦GnRH神經(jīng)元形成突觸連接。CSF中存在大量褪黑素(Melatonin，MT)，其濃度隨光周期而變化，TSHR可能通過感知MEL濃度變化，通過一系列信號轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)下游GnRH分泌，進而影響動物季節(jié)性繁殖活動[39]。Kijas等[4]使用綿羊SNP50芯片對世界各地74個品種2 819只綿羊進行掃描，發(fā)現(xiàn)與生長和繁殖有關的基因TSHR受到選擇。Fariello等[5]對Kijas等研究者獲得的相關數(shù)據(jù)進一步分析，推測綿羊馴化歷史進程中TSHR基因突變可能導致綿羊由季節(jié)性繁殖向常年繁殖轉(zhuǎn)變。同時國內(nèi)的許多研究結果均提示TSHR基因與綿羊季節(jié)性繁殖性狀具有較強的相關性[6-10]。

其中TSHR參與綿羊的詳細季節(jié)性繁殖機制如下：外界長光照信號經(jīng)過綿羊腦部一系列轉(zhuǎn)化，刺激PT內(nèi)眼缺失基因3(Eyes absent 3,EYA3)表達變化，EYA3可與正弦相關同源盒1(Sine oculis-related homeobox 1, Six1)、促甲狀腺胚胎因子(Thyrotroph embryonic factor, Tef)及肝白血病因子(Hepatic leukemia factor, HLF)共同組成復合體與TSHβ 啟動子結合促進PT內(nèi)TSHβ的表達[11]。TSHβ與下丘腦TSHR結合[40]，促進第二信使環(huán)狀單磷酸腺苷(Cyclic AMP, cAMP)表達，這種正反饋途徑進一步增加PT內(nèi)TSHβ表達[41-42]。Ono等[43]發(fā)現(xiàn)TSHR敲除(TSHR-KO)小鼠與正常小鼠相比PT內(nèi)TSHβ表達水平降低，暗示TSHR可能通過正反饋回路刺激PT內(nèi)TSHβ表達。綿羊TSHR與TSHβ結合刺激EC內(nèi)DIO2表達[3,44]，進而刺激三碘甲狀腺原氨酸(Triodothyronine, T3)與四碘甲狀腺原氨酸(Tetraiodothyronine, T4)相互轉(zhuǎn)化，高濃度的T3抑制性腺軸的活性，此時綿羊進入休情狀態(tài)[45-46]。TSHR參與綿羊的季節(jié)性繁殖機制圖見圖2。

圖2 TSHR調(diào)控綿羊的季節(jié)性繁殖機制

3.2 TSHR對禽類季節(jié)性繁殖的調(diào)控

鳥類與哺乳動物的季節(jié)性繁殖的分子機制雖有不同之處，但在涉及TSH參與的季節(jié)性繁殖通路上是保守的：TSHR與TSHβ相互作用間接調(diào)控T3濃度，T3作用于性腺軸調(diào)節(jié)動物發(fā)情性狀[47]。

TSHR突變與家畜季節(jié)性繁殖有關，也深刻影響雞的馴化特性[48]。TSHR突變可能通過改變血漿中甲狀腺激素水平影響雞的馴化特性，因此在家雞進化過程中起重要作用[49-50]。有研究者通過對8個品種家雞和野生紅色原雞的全基因組重測序，發(fā)現(xiàn)TSHR基因在雞馴化過程中受到選擇，并推測TSHR基因突變可能與雞季節(jié)性繁殖相關[49,51]。隨后，Karlsson等[41]針對TSHR基因使用紅色原雞(RJF-w/w)與白來航雞(WL-d/d)作為研究對象，發(fā)現(xiàn)光照改變使d/d型母雞TH水平發(fā)生變化，導致與w/w型母雞相比，產(chǎn)蛋時間提早，卵巢更活躍。并且發(fā)現(xiàn)短光照下公雞TSHR、TSHβ和DIO3的表達水平降低，導致睪丸縮小。揭示TSHR突變調(diào)控了雞的季節(jié)性繁殖活動。以上結果均表明TSHR基因在禽類季節(jié)性繁殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用。且TSHR基因調(diào)控禽類季節(jié)性繁殖機制與哺乳動物相似，長光照刺激禽類深層腦感光細胞[52-53]，進一步轉(zhuǎn)化為神經(jīng)內(nèi)分泌反應，傳遞至PT區(qū)域，刺激PT表達TSHβ。TSHβ與下丘腦的TSHR結合誘導DIO2表達，DIO2促使T4轉(zhuǎn)換為T3[38,53-54]。高濃度的T3導致LH和FSH的分泌增加，進而促進性腺生長[55]。

3.3 TSHR多態(tài)性與季節(jié)性繁殖的關系

目前，國外內(nèi)研究者發(fā)現(xiàn)綿羊TSHR基因突變位點與季節(jié)性繁殖相關。竇立靜等[6]在綿羊TSHR基因CDS區(qū)發(fā)現(xiàn)c.31A>G錯義突變位點，分析表明該位點在不同繁殖特性(季節(jié)性繁殖和常年繁殖)綿羊群體的基因型和等位基因頻率有明顯不同的分布趨勢，G等位基因與綿羊常年繁殖性狀具有顯著的相關性。該突變可能導致TSHR構象發(fā)生變化，使其與TSH的結合能力改變，進而影響繁殖機制下游，最終調(diào)控綿羊的季節(jié)性繁殖活動。Rubin等[51]深入研究發(fā)現(xiàn)雞TSHR基因Gly558Arg位點是一個重要的錯義突變，位于TSHR第4跨膜結構域與胞外loop交界處；Gly突變?yōu)锳rg導致氨基酸由跨膜區(qū)移到胞外區(qū)，從而影響配體的結合。這個突變大約在1 100年前受到高強度選擇，在現(xiàn)代雞種中它幾乎被固定為Arg[41,56]。Karlsson等[41,49]通過關聯(lián)分析證明了Gly558Arg表型效應。Arg型比Gly型雞產(chǎn)蛋性能更好、孵化期更短、神經(jīng)敏感性和好斗性更低。軒俊麗等[8]發(fā)現(xiàn)綿羊TSHR基因外顯子SNP1、SNP3、SNP4和SNP5 4個位點的多態(tài)性在烏珠穆沁羊和湖羊群體中存在極顯著差異，SNP3、SNP4和 SNP5位點的改變均導致mRNA二級結構發(fā)生改變，致其表達和成熟異常，進而與繁殖性狀變異相關。寸靜宇等[9]和夏青等[10]檢測了常年繁殖綿羊和季節(jié)性繁殖綿羊TSHR基因的共5個SNP位點，這5個位點基因型頻率和等位基因頻率在常年繁殖綿羊品種和季節(jié)性繁殖綿羊品種間差異均達到顯著水平，表明TSHR基因及多態(tài)性與綿羊季節(jié)性繁殖性狀具有較強的相關性。

4 結束語

綜上可以看出，TSHR基因的研究已取得一定進展，TSHR基因結構、組織表達特性已基本明確。并且卵巢TSHR對動物卵巢功能調(diào)控以及下丘腦TSHR對綿羊及禽類季節(jié)性繁殖調(diào)控分子機制已經(jīng)初步清晰。從現(xiàn)有的研究可以看出TSHR對動物季節(jié)性繁殖至關重要，相信隨著進一步對TSHR在哺乳動物季節(jié)性繁殖調(diào)控中作用機制的研究，必將會解決綿羊季節(jié)性繁殖中存在的疑難問題，大大提高養(yǎng)羊效率。