蠟酯合成酶的研究進展及其應用

肖一凡 彭 杰 張 揚 史碩博,2*

(北京化工大學 1.北京軟物質科學與工程高精尖創新中心，北京 100029；2.秦皇島環渤海生物產業研究院，秦皇島 066000)

引 言

蠟酯(wax ester)是由長鏈脂肪酸與長鏈醇通過酯化反應結合形成的，兩部分分子通常都是長鏈(C16和C18)或超長鏈(C20或更長)的碳結構。蠟酯在動物、植物和微生物中廣泛存在，具有多種重要的生物學功能，對生物的生命活動具有非常重要的意義。植物中的蠟酯主要存在于覆蓋初生芽表面的角質層中或者以高濃度的形式積累在一些種子油中，可防止水分流失[1]、紫外輻射[2-3]及致病菌的襲擊[3]等；某些動物體內也含有較多的蠟酯，如抹香鯨的鯨油可傳遞聲音、調節浮力等[3-4]；各種細菌通過積累蠟酯將其作為主要的碳源和能量儲存物質[3,5]。由于蠟酯具有多種多樣的功能和性質，其可作為人類生活中的一種重要的經濟油脂，廣泛應用于醫藥、化妝品、食品工業，尤其是能源、化工等領域[6-10]。

近年來，作為商用蠟酯主要來源的動植物蠟酯受有限資源的限制已不能滿足不斷增長的市場需求。例如商用蠟酯最早的主要來源是鯨蠟油，自從20世紀60年代全球禁止捕鯨以來，蠟酯主要通過昂貴的化學前體合成或者從植物霍霍巴(Simmondsiachinensis)油脂中提取獲得，這導致其供應不足且成本高昂，因此仍需尋找廉價的、可持續生產的有效方案。

通過構建人造微生物細胞工廠進行高效生物制造，已被科學界及工業界認可。生物體內的蠟酯一般由長鏈脂肪酸與長鏈醇在蠟酯合成酶(wax ester synthase,WS)的催化下生成。近年來，利用不同來源的WS高效合成各種蠟酯化合物已經成為研究熱點。為了滿足生活中對酯類化合物的大量需求，人們嘗試從各種生物中尋找WS，期望以此為基礎構建一種高效而成本低廉的微生物細胞工廠用于酯類化合物的合成。WS的底物特異性很低[7]，人們可以通過調控底物類型及生長條件、菌株改造、使用酶工程等手段使其生產不同類型的產物[8]。例如，生物柴油是一種由短鏈醇與長鏈脂肪酸構成的酯類化合物，其成分主要是脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯，目前主要由動植物油脂經化學轉酯反應生產，該方法的缺點是生產成本高、易造成環境污染等。為了解決這些問題，近年來，利用WS通過微生物發酵的方法生產生物柴油得到廣泛關注，并取得一系列研究進展[7-10]，通過催化脂肪酸和相應短鏈醇的酯化反應，成功創建了生產脂肪酸乙酯、脂肪酸丁酯[7,10]等不同生物柴油分子的細胞工廠。但是WS的最適底物不是短鏈醇，這就造成細胞工廠中產物的轉化效率非常低，促使人們通過合成生物學或者蛋白質工程等手段來改造WS。

WS是催化生成蠟酯及相關酯類化合物的關鍵酶，其應用和改造已成為相應菌株構建的技術難題和關鍵因素。目前，人們已經從多種生物中鑒定和表征了具有蠟酯合成活性的WS，并將其分為兩大類。第一類屬于典型的WS，它們僅對蠟酯合成具有活性，從哺乳動物(例如人和小鼠)以及高等植物(例如霍霍巴和矮牽?；?中鑒定并純化[4,11]，有望提高霍霍巴油等蠟酯的產量；第二類是具有WS和二?；视王；D移酶(diacylgycerol acyltransferase,DGAT)活性的雙功能酶，即WS/DGAT，其首次從貝氏不動桿菌(Acinetobacterbaylyi)中鑒定出[12-13]，主要在微生物中表達并用于催化脂肪酸和相應短鏈醇酯化而生成生物柴油分子。通過比較不同WS對不同底物的活性差異及對其活性位點進行改造，可以改變產物的分子組成，使其具有不同的性質和用途。

本文系統論述了微生物、動物和植物體內的蠟酯合成途徑及WS的研究進展，包括：不同來源WS的開發及表征，通過酶工程方法對WS的改造和優化以及近年來WS在生物制造領域中的應用。最后探討了利用WS合成酯類化合物面臨的挑戰，并對其研究前景進行了展望。

1 蠟酯的合成途徑

通過對自然界中蠟酯生物合成途徑的詳細研究，人們發現蠟酯在不同物種中的合成途徑略有不同，但其中最后一步都是由WS催化的。

1.1 微生物中蠟酯的合成途徑

在微生物中，蠟酯是潛在的碳源和儲能的化合物。1997年Reiser等[13]在A.baylyiADP1中發現、鑒定了微生物的蠟酯合成途徑。如圖1中A途徑所示，其合成途徑主要分為3步：第一步，酰基輔酶A(?；鵆oA)被?；鵆oA還原酶(acyl-CoA reductase,ACR)還原成相應的脂肪醛；第二步，脂肪醛被脂肪醛還原酶(fatty aldehyde reductase)進一步還原成相應的脂肪醇；最后，?；鵆oA脂肪醇轉移酶(fatty alcohol acyl-CoA transferase)將脂肪醇與酰基CoA縮合，合成相應的蠟酯。其中?；鵆oA還原酶、脂肪醛還原酶是依賴于還原型輔酶Ⅱ(NADPH)發生作用的，?；鵆oA脂肪醇轉移酶隨后被命名為蠟酯合成酶。2003年Kalscheuer等[12]又對A.baylyiADP1中蠟酯合成的關鍵酶進行了鑒定，證明其同時具有DGAT和WS的活性。St?veken等[14]于2005年進一步證明了A.baylyiADP1的蠟酯合成酶除具有DGAT和WS的活性外，還具有單酰甘油?；D移酶(monoacylglycerol acyltransferase,MGAT)的活性，能夠接受多種物質作為替代受體分子，其中對中鏈醇表現出最高的特異性。

Holtzapple等[15]于2007年提出了海桿菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)DSM 8798中異戊二烯類蠟酯的合成途徑。在此途徑中，植醇首先經過脫氫酶被氧化為植醛類化合物，然后植醛通過醛脫氫酶被進一步氧化為植酸；同時，植酸被類異戊二烯/酰基CoA合成酶激活為植烷?；鵆oA，植烷酰基CoA和植醇通過WS合成類異戊二烯類蠟酯。2017年Tomiyama等[16]鑒定了小眼蟲(Euglenagracilis)中的WS/DGAT，證實其參與了厭氧條件下小眼蟲體內蠟酯的形成。其體內蠟酯主要是肉豆蔻醇肉豆蔻酸酯(C28)和大量的C26/C27酯類，由中鏈脂肪酸和C10至C18的醇組成，其中具有C14:0脂肪酸的蠟酯占總蠟酯質量的44%。

1.2 動物中蠟酯的合成途徑

Cheng等[4,17]首次表達鑒定了小鼠的兩個脂肪酰基CoA還原酶(fatty acyl-CoA reductase,FAR)，這兩個同工酶FAR1和FAR2分別被其cDNA編碼，同時還表達鑒定了小鼠包皮腺中的WS，揭示了哺乳動物中蠟酯的合成途徑。如圖1中B途徑所示，其蠟酯合成包括由脂肪酰基CoA還原酶和WS催化的兩步生物合成途徑。該研究證實了脂肪?；鵆oA是FAR1的底物，該酶需要NADPH作為輔因子；指明WS在細胞中的表達可以使飽和、不飽和、多不飽和脂肪醇和脂肪酰基CoA合成蠟酯；還發現蠟酯合成酶mRNA在富含皮脂腺的組織(包括眼瞼和皮脂腺)中含量最高，而在其他組織中含量較低。

1.3 植物中蠟酯的合成途徑

植物中脂肪酸的代謝途徑主要有兩條：第一條是酰基還原途徑，可產生蠟酯，蠟酯在生成過程中雖然需要醛類中間體，但并不釋放出來(如圖1中C途徑所示)；另一條是脫羰基化途徑，可形成醛、烷烴、仲醇和酮[11]。

霍霍巴油是目前商用蠟酯的主要生物來源，可用于化妝品領域，由油料作物霍霍巴合成?；艋舭蚖S的cDNA于2000年在轉基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)中首次被異源表達，Lardizabal等[19]利用酰基CoA和脂肪醇鑒定了該酶的特性，證明了WS的底物和產物具有親脂性，還發現WS非常疏水，具有多個潛在的跨膜結構域。Sturtevant等[18]在2020年用霍霍巴基因組中的相應基因詳細繪制了酰基-脂質代謝途徑，發現已知與蠟酯合成有關的基因(ScFAE1、ScFAR和ScWS)都高度表達，并且明顯偏向子葉組織，而三酰甘油合成中的一種末端酶霍霍巴?；鵆oA:DGAT1(ScDGAT1)在胚軸組織中顯著表達。他們分析標注這些基因，對于霍霍巴植物的基因和代謝的改造具有重要意義。

擬南芥中含有12種WS的同源物，2008年Li等[11]在大腸埃希菌(Escherichiacoli)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表達并鑒定了擬南芥中蠟酯合成的關鍵酶WSD1，確定了WSD1參與擬南芥莖蠟酯的形成，并且是催化蠟酯生物合成途徑的最后一步的主要酶。該研究發現該酶位于內質網，為今后酶工程的改造以及前體物的有效供應指明了方向。

2 蠟酯合成酶的特性及改造

隨著越來越多的WS被鑒定，了解這些酶的底物范圍和特異性并進行酶工程改造，對工業微生物定向生產蠟酯有著深遠影響。本文總結了幾種具有代表性的WS的生化特性及活性改造進展。

2.1 蠟酯合成酶的生化特性

近年來，各種生物中WS的性質和底物范圍被逐步測定，人們發現大多數WS有著廣泛的底物范圍，且與中長鏈酯酰CoA和中長鏈醇有較好的親和力，這些表征信息對工業化定向生產不同鏈長的蠟酯有重要意義。

2.1.1微生物中WS的生物性質

海桿菌是革蘭氏陰性菌，在M.hydrocarbonoclasticusDSM 8798中，Holtzapple等[15]鑒定了4個編碼WS的潛在基因，但是，只有2個基因MhWS1和MhWS2編碼的蛋白經E.coli表達純化后可以在體外檢測到WS的活性。隨后，Shi等[20]在S.cerevisiae細胞中表達MhWS2，并且在體外檢測到MhWS2具有廣泛的底物偏好性，發現MhWS2更傾向于催化棕櫚酰CoA(C16:0-CoA)和中長鏈脂肪醇(C10-OH～C16-OH)的反應。R?ttig等[21]于2015年在E.coli中表達了MhWS2，但是由于MhWS2無法高效可溶表達，很難得到足夠高的純化量。通過酶動力學分析，他們發現MhWS2對C16:0-CoA顯示出很高的親和性，而短鏈的酰基CoA則很難被MhWS2轉化。Miklaszewska等[22]在2018年詳細測定了MhWS2蛋白的底物特異性，他們利用酵母表達，通過干燥的微粒體來測定酶的活性，結果顯示該酶在體內和體外均顯示出高的WS活性，但是并沒有發現其具有DGAT的活性。通過體外實驗，檢測到MhWS2在較寬的溫度范圍(45～55 ℃)和pH范圍(5.5～10)內表現出較強的活性，且能催化的底物范圍較為廣泛。在使用C12:0-CoA、C14:1-CoA、C16:0-CoA、C18:0-CoA和C18:1-CoA作為?；w時，除了飽和的C20～C24醇利用率很低外，大多數脂肪醇都可以被MhWS2有效地利用。由于在工業生產中生產蠟酯需要調整酵母培養條件，而MhWS2在較寬范圍的溫度、pH下的高活性表明了其在工業生產中的潛力和優勢。

40多年前人們在革蘭氏陰性不動桿菌屬中首次發現了細菌蠟酯。Kalscheuer等[12]鑒定了不動桿菌中的雙功能蠟酯合成酶AtfA(WS/DGAT)，揭示了其具有廣泛的底物特異性，能夠接受C2～C20的飽和、不飽和?；鵆oA和C2～C30的線性醇以及支化、環狀或芳香醇作為底物。R?ttig等[9,21]通過體外實驗測定了純化的蠟酯合成酶AtfA、AtfA(G355I)和AtfA1(Alcanivoraxborkumensis)對不同底物的活性，發現AtfA對底物C16:0-CoA和不飽和醇(C16:1或C18:1)的比活性最高，對較短鏈的醇(如乙醇或丁醇)的活性較低；當底物濃度超過0.04 mmol/L(C16:0-CoA)或0.2 mmol/L(正十六醇)時，出現了很強的底物抑制作用；而采用正十二醇(濃度在0.6 mmol/L以下)和乙醇則沒有發現明顯的底物抑制現象，但當使用300 mmol/L以上的甲醇時，該酶的活性急劇下降。對乙醇等短鏈醇底物和棕櫚酰CoA以及較短的?；鵆oA底物反應的比較發現，與AtfA相比，AtfA(G355I)對以上底物的活性較低，突變并沒有增加其對短鏈醇底物的比活性，但提高了對乙醇的催化效率和親和力，這說明AtfA(G355I)對乙醇和短鏈?；鵆oA底物的催化效率和親和力有著積極的影響。與其他同源?；D移酶相比，AtfA1的最適底物為C16:0-CoA和C12醇，但AtfA1的總比活性非常低。綜上，AtfA仍然具有較大的底物特異性潛質，是生產脂肪酸短鏈酯的最優選擇之一。

迄今為止，關于真核微生物WS的報道一直很少，直到2017年Zhang等[23]首次報道了從海洋生物破囊壺菌(Thraustochytriumroseum)中鑒定的兩種雙功能WS/DGAT蛋白TrWSD4和TrWSD5，并通過E.coli表達，經體外實驗分析了這兩種WS/DGAT的偏好性。用C16-OH與酰基受體反應，經動力學特征(米氏常數Km和催化效率kcat/Km，其中kcat為酶的催化常數)比較，發現C12:0-CoA是TrWSD4的最適底物，而C10:0-CoA是TrWSD5的最適底物。在S.cerevisiae中分別表達TrWSD4和TrWSD5后，表達TrWSD4的工程酵母僅可合成蠟酯混合物，而表達TrWSD5的工程酵母還可額外合成棕櫚酸乙酯(生物柴油的主要成分)，揭示了TrWSD5具有生產生物柴油的潛力。

2.1.2動植物WS的生物性質

Cheng等[4,17]鑒定了小鼠的WS，對其亞細胞定位進行了表征，通過實時聚合酶鏈反應(real-time PCR)對mRNA分析并確定了其組織分布。他們從小鼠包皮腺中分離出脂肪酸和脂肪醇，分析了WS對底物的偏好性，發現合成的蠟酯中相應脂肪酸成分的組成豐度大小順序為：C16:1>C18:1>C16:0>C20:0>C14:0，脂肪醇成分的主要組成為C16:0。Miklaszewska等[24]于2013年在S.cerevisiae中異源表達了小鼠WS，使用轉基因酵母的微粒體進行體外酶活測定，發現除了具有WS的活性外，小鼠WS還表現出很低的?；鵆oA:DGAT的活性，沒有發現具有?；鵆oA:MGAT和酰基CoA:甾醇酰基轉移酶的活性。他們通過評估小鼠WS對11種酰基CoA與17種脂肪醇底物的組合偏好，發現該酶與中鏈醇反應時對C14:0-CoA、C12:0-CoA和C16:0-CoA表現出最高的活性(每分鐘每毫克微粒體蛋白可分別產生高達5.2、3.4 nmol和3.3 nmol的蠟酯)。在飽和醇與不飽和醇中，該酶對碳鏈超過18個碳的不飽和醇表現出高活性。在所有測試的醇與C20:0-CoA、C22:1-CoA或Ric-CoA的組合中，小鼠的WS無法充分利用這些底物，且對共軛?；鵆oA也沒有表現出活性。通過上述酶的體外表征，表明小鼠的WS最適于合成中鏈蠟酯。

Biester等[25]于2012年在酵母中進行了禽類的幾種WS蛋白的表征，比較了不同禽類(包括雞、鵝、谷倉貓頭鷹等)WS的底物特異性，發現所有禽類WS對飽和的中鏈醇(C10:0-OH～C12:0-OH)和飽和的長鏈?；鵆oA(C14:0-CoA～C18:0-CoA)的活性最高，其中雞的WS(GgWS1和GgWS2)還對支鏈酰基CoA保持較高活性；用受測物種的腺體膜作為酶源對不同酰基受體的酶活反應比較證明，所有受測物種的腺體膜均能夠催化直鏈醇(尤其是C12:0-OH)或支鏈醇(如香葉基香葉醇等)。除WS活性以外，雞的腺體膜還顯示出較高的DGAT活性以及二酯合酶(diester synthase)活性。這些信息對于合成支鏈蠟酯具有特殊的指導價值。

King等[26]于2007年鑒定了矮牽牛WS，發現其在花瓣中產生低分子量的角質蠟，用14C標記的C16:0-CoA和一系列直鏈、支化、芳香和萜類化合物醇進行酶活測試，觀察到矮牽牛WS對C8-OH～C12-OH醇具有較高活性。Li等[11]于2008年在酵母H1246中表達了擬南芥蠟酯合成酶WSD1，發現當在培養基中添加棕櫚酸和鏈長為C18、C24或C28的醇時表達WSD1的工程菌株皆可合成相應的蠟酯，但是該酶并不催化短鏈醇(內源醇)生成相應的酯類，表明WSD1可接受長鏈醇合成長鏈蠟酯。不同WS的底物偏好性的總結見表1。

表1 不同WS的底物偏好性Table 1 Substrate preferences of different wax ester synthases

2.2 蠟酯合成酶的活性改造

在獲取WS的晶體及結構之前，研究人員往往通過序列對比、結構預測、隨機突變等手段來推斷WS的序列和功能的關系，并進行相應改造。2009年St?veken等[27]對WS/DGAT家族的幾種細菌?；D移酶進行序列對比，發現了高度保守的HHxxxDG基序。他們用亮氨酸取代了不動桿菌的蠟酯合成酶AtfA中該基序的部分序列：第一個組氨酸殘基(H132)的取代顯著降低了酶活，而第二個組氨酸殘基(H133)的取代幾乎使酶喪失了活性，當兩個組氨酸殘基同時被取代時，酶活則完全喪失，說明這兩個殘基都是AtfA酶發揮活性所必需的。為了進一步了解酶的序列與功能之間的關系，R?ttig等[9,21]對A.baylyi的atfA基因進行了隨機誘變、篩選，檢測到AtfA的C端Glu15Lys、Trp67Gly、Ala126Asp、Ser374Pro或Gly378Ser/Asp這幾種突變嚴重降低了A.baylyi中的脂質積累和AtfA活性，并據此推測AtfA的C端部分是酶活不可缺少的部分，并猜測C端可能形成二聚化結構域。他們又對AtfA進行了突變得到突變體AtfA(G355I)[21]，發現AtfA(G355I)提高了對乙醇等短鏈醇底物的親和力。類似地，Barney等[28-29]利用Multalin法通過序列對比推測了影響WS底物偏好性的殘基，對應突變了海桿菌(MarinobacteraquaeoleiVT8)的蠟酯合成酶(WS1)，對突變體進行了活性研究，發現在Leu356、Ala360和Met405上用較大或較小的疏水殘基取代，可以使相應突變體對短、支化和芳香醇具有不同的選擇性，從而用于合成不同類型的蠟酯。

高精度的蛋白結構有助于闡明WS在微生物中高效催化與專一性的分子機制，進而以高精度預測其催化結構域及活性位點，設計活性、專一性、穩定性改變的突變體。但直到2018年Petronikolou等[30]才得到了WS家族第一個晶體結構，為來自M.aquaeoleiVT8的蠟酯合成酶(Ma-WS/DGAT，同源蛋白WS1)。晶體結構顯示該酶由兩個結構域組成：①N端結構域，由混合的β-折疊(鏈β1、β4、β5、β6、β11)和一個小的反平行β-折疊(鏈β2和β3)構成，其中β-折疊(鏈β1、β4、β5、β6、β11)兩側有4個α螺旋(螺旋α1～α4)；②C端結構域，由混合的β-折疊(鏈β7～β10和β12～β13)組成，一側覆蓋有4個α螺旋(α6、α7、α8、α10)，另一側與螺旋α9和N端結構域相對。通過結構分析發現之前確定的WS家族HHxxxDG保守基序位于N端結構域核心長腔(口袋1)并延伸到C端(口袋2)中的一個回路上；根據兩個保守的His的空間位置，發現His136是蛋白發揮催化作用的基團；通過結構數據指出?；鵆oA的?；溄Y合在N端結構域核心形成的口袋(口袋1)中，并構建了相應WS突變體(口袋1中Gly25→Val和Ala144→Phe)，進行底物分析后發現兩種突變體最適底物的變化與預測一致，更傾向于鏈長較短的?；孜?。WS家族晶體結構出現后，人們可以根據結構有目的地進行突變并分析WS的序列和功能之間的聯系，WS蛋白的改造將具有較高的可預測性和可控性。

目前人們對WS序列和結構的研究尚處于起步階段，相關的有效突變位點較少(如表2所示)。目前仍然是通過簡單的生物信息學分析其序列和保守區，或者通過隨機突變來改變WS的功能。WS家族第一個晶體結構的出現成為目前WS研究上的一項重大進展[30]，然而由于不同WS的蛋白同源性低，通過相似性模擬其他WS的構效關系具有較差的預測精度。未來會出現更多的WS結構，將更好地指導對WS的特異性改造，為微生物細胞工廠高效合成特定成分的蠟酯打下基礎。

表2 WS的改造Table 2 Modifications of wax ester synthases

3 蠟酯合成酶在酯類化合物生產中的應用

目前利用WS的不同底物特異性，同時采取合成生物學手段改變宿主脂類代謝，已開發了多種細胞工廠以使WS應用于不同酯類化合物的生產。

3.1 應用于蠟酯生產

利用微生物高效生產具有不同用途的蠟酯一直是人們關注的焦點，為了提高蠟酯的產量，將尋求合成生物學手段實現相應前體物的供應。2018年，Lehtinen等[31]通過在A.baylyiADP1中異源表達來自Nevskiaramosa的?；鵆oA還原酶基因，在菌體中實現過量生產蠟酯合成的異源性前體物脂肪醛，使蠟酯產量達到了0.45 g/L。但是，由于脂肪酸前體供應不足，不動桿菌屬能夠產生的蠟酯含量很難超過細胞自身干重的15%[32]，因此，在其他菌種中表達WS，有可能進一步提升蠟酯產量。

霍霍巴蠟酯是一種性質獨特的蠟酯，只能在霍霍巴植物的種子中得到，具有獨特的醫療作用，如治療皮膚感染、加速傷口愈合等[33]?；艋舭拖烏ナ怯砷L鏈脂肪酰CoA和長鏈脂肪醇通過WS催化形成的超長鏈蠟酯，其組成成分主要是碳鏈為C42:2的蠟酯[34]。在S.cerevisiae中最常見的脂肪酸碳鏈長度是C16和C18，而超長鏈脂肪酸的含量很低[35]，即使引入WS和FAR后，受自身前體供應的限制，工程酵母僅可合成碳鏈長度是C28～C36的蠟酯[36]，而這些蠟酯在天然霍霍巴蠟酯中占比非常小。Wenning等[37]嘗試在S.cerevisiae中異源表達來自M.aquaeoleiVT8的FAR和來自S.chinensis的WS基因，同時過表達S.cerevisiae內源β-酮?；鵆oA合酶Elo2p，首次在未經外源添加脂肪酸或脂肪醇作為底物的條件下合成了超長鏈霍霍巴蠟酯(C40:0-WE和C42:0-WE)。在此基礎上，他們于2019年將來自Crambeabyssinica的脂肪酸延伸酶(FAE/KCS)和S.cerevisiae內源的脂肪酸脫飽和酶(FAD)Ole1p共表達，使霍霍巴蠟酯的產量相比出發菌提高了2.3倍[38]。目前，通過合成生物學改變宿主中蠟酯前體物碳鏈的成分和構成，進而通過WS催化合成所需蠟酯的研究還較少，但具備良好的應用及科學價值。

3.2 應用于三酰甘油生產

與蠟酯一樣，三酰甘油也是一種中性酯，可作為功能性油脂應用于食品、保健領域。由于蠟酯合成酶具有雙功能，即WS及DGAT活性，理論上也可用于生成三酰甘油。2019年，Santín等[39]在E.coli中異源表達了來自Thermomonosporacurvata的WS/DGAT，使E.coli有了生產三酰甘油的能力，并通過易錯PCR對導入的WS酶序列進行了隨機突變，通過尼羅紅熒光染色進行定向篩選，最終得到了三酰甘油積累量是突變前2.5倍的突變菌株。該方法展現了高通量篩選以及隨機突變在酶工程中的應用潛力，可用于快速篩選其他可合成中性酯的酶，或者篩選對特定底物有活性的突變體。

3.3 應用于脂肪酸乙酯生產

生物柴油可由長鏈脂肪酸和短鏈醇(主要是甲醇和乙醇)進行酯化反應產生，分子組成為脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯。相對于傳統石油燃料，生物柴油具有可再生、無毒性、閃點高、易燃性低、使用安全性高等優點。如上文所述，WS具有極廣的底物范圍，這一性質被用來在各種重組宿主體內合成不同的生物柴油分子。對于脂肪酸乙酯的生產而言，最早被發現的WS的天然宿主A.baylyi是嚴格的需氧生物，其無法產生脂肪酸乙酯的重要前體乙醇，不是理想的生產菌株，因此，人們開始尋找其他工業菌株作為生產宿主。

2006年，Kalscheuer等[40]將丙酮酸脫羧酶基因(pdc)和乙醇脫氫酶基因(adhB)導入E.coli以構建乙醇合成途徑，然后將來自A.baylyiADP1的WS基因導入E.coli，重組菌株能夠產生大量的乙醇并成功表達WS，但是E.coli自身產生的脂肪酸不足以支撐脂肪酸乙酯的合成，只有在外源添加大量脂肪酸的前提下才能正常生產脂肪酸乙酯。2015年，R?ttig等[41]改造了E.coli脂肪酸合成途徑以增加脂肪酸乙酯生產的前體，之后分別將不同來源的10種?；D移酶基因在E.coli體內異源表達，發現將來自A.baylyi的WS進行點突變后得到的突變體AtfA(G355I)最適合脂肪酸乙酯的合成，最終產量可達到500 mg/L。

相對于E.coli，S.cerevisiae自身有著高效率的乙醇生產途徑，且正常生長過程中積累的脂質主要含C16和C18鏈長的脂肪酸[42]，這些脂肪酸很適合生產脂肪酸乙酯[43]。Yu等[10]于2012年將S.cerevisiae的甘油產乙醇途徑和WS/DGAT產脂肪酸乙酯途徑結合，在消耗17 g/L甘油的條件下得到0.52 g/L脂肪酸乙酯。2014年，Thompson等[44]將WS基因導入S.cerevisiae，然后利用多種方法，如過表達內源脂肪酸合成酶(FAS)以增強脂肪酸的合成途徑，敲除β氧化等競爭途徑基因以及對酰基轉移酶基因進行密碼子優化等，最終將S.cerevisiae自身的脂肪酸乙酯產量提高到25 mg/L。2015年，Eriksen等[45]將來自M.hydrocarbonoclasticusDSM 8798的WS基因和放線菌的Ⅰ型FAS酶基因導入S.cerevisiae，嘗試在S.cerevisiae中引入異源的脂肪酸合成途徑以進一步增加脂肪酸乙酯的產量，最終使產量相比未導入異源FAS酶基因時提高了6.3倍。

S.cerevisiae生產脂肪酸乙酯受到的限制主要在于它自身生產脂肪酸的能力較低，而一些產油酵母可能具有更好的生產潛力。它們能積累大量的脂質，最多可以達到其生物量的60%(質量分數)，經過改造的工程化解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)產生的脂質產量高達72.7 g/L[46]。因此，Y.lipolytica等產油酵母可能具有非常大的脂肪酸乙酯生產潛力。Xu等[47]僅將過氧化物酶體/線粒體肉堿酰基轉移酶perCat2過表達和WS異源表達相結合，得到的脂肪酸乙酯產量就達到142.5 mg/L。2018年，Gao等[48]將不同物種的WS基因經過密碼子優化后在Y.lipolytica中異源表達，證明了來自M.hydrocarbonoclasticusDSM 8798菌株的WS基因生產脂肪酸乙酯的效率最高，之后他們通過敲除β-氧化、優化WS基因啟動子等操作，最終使脂肪酸乙酯的產量達到了1.18 g/L，該酵母是目前報道的脂肪酸乙酯產量最高的重組酵母。

如上所述，在不同菌株中表達WS生產脂肪酸乙酯的研究中，產油酵母Y.lipolytica具有強大的脂肪酸積累能力和較強的脂肪酸乙酯生產能力，可能是生產脂肪酸乙酯等脂肪酸類生物產品的潛力巨大的菌株。

3.4 應用于脂肪酸短支鏈酯生產

目前市場上的生物柴油多為脂肪酸甲酯和脂肪酸乙酯，研究表明相對于相同鏈長的直鏈酯，具有支鏈醇的脂肪酸酯(例如脂肪酸異丙酯、脂肪酸異丁酯)的傾點和濁點會降低，表現出良好的冷流性；同時支鏈酯的十六烷值也高于相同鏈長的直鏈酯，因此具有更好的燃料性能[49]。

相對于生產脂肪酸乙酯，微生物利用WS生產脂肪酸短支鏈酯(fatty acid short-and branched-chain esters,FASBEs)的研究較少。2006年Kalscheuer等[7]將來自A.baylyiADP1的WS基因導入E.coli中，探究異源蠟酯的生物合成途徑，意外地檢測到脂肪酸丁酯的形成，他們將這一結果歸因于培養基的胰蛋白胨中含有痕量的1-丁醇。這一結果證明WS的底物特異性很低，能夠利用各種長度的醇類。2015年Tao等[50]嘗試在E.coli中導入WS基因，同時結合E.coli支鏈脂肪酸合成途徑與支鏈氨基酸生物合成途徑，以提供異丁醇和3-甲基-1-丁醇前體，得到273 mg/L的脂肪酸支鏈酯。他們將同樣的策略用于畢赤酵母(Pichiapastoris)，得到169 mg/L的脂肪酸支鏈酯。在另一項研究中，Teo等[51]將2種蠟酯合成酶基因(來自Marinobactersp.的WS2和Maqu_0168)導入S.cerevisiae，同時過表達S.cerevisiae內源的異丁醇途徑酶，經優化得到產量達230 mg/L的脂肪酸短鏈酯，包括脂肪酸乙酯、脂肪酸丙酯、脂肪酸丁酯、脂肪酸異丁酯、脂肪酸異戊酯等。

上述研究利用合成生物學改造宿主使其提供短鏈支鏈醇，合成相應的脂肪酸短支鏈酯，展現了WS在生物能源領域中的巨大潛力，其不僅可以合成傳統的生物燃料脂肪酸乙酯或脂肪酸甲酯，還可以合成性能更優的新型燃料分子。WS在酯類化合物生產中的應用的總結見表3。

4 總結與展望

應用WS生產各種酯類的核心問題是如何改變酯類的化學成分以及如何提高酯類的產量，解決這些問題的關鍵在于提高WS的活性及改變它的特異性，目前對WS的優化主要也是朝著這個方向進行的。為了讓工程菌株生產特定成分的酯類，可以對自然界中發現的大量WS進行篩選和表征，也可以通過蛋白質工程改造WS的最適底物，或者通過建立有效的篩選系統進行酶的定向進化以得到更適合生產目標酯類的酶[9,39]。例如WS具有高度保守的HHxxxDG基序，該基序的隨意替代會使酶的活性明顯降低[27]，將來自M.aquaeoleiVT8的WS的部分位點進行突變后能改變其對醇類的選擇性[28-29]，對A.baylyi的蠟酯合成酶AtfA進行點突變得到的AtfA(G355I)則能夠使其失去DGAT酶活性，同時提高脂肪酸乙酯的產量[41]。如何進一步改造WS使其更有利于生產應用將是未來研究的重點之一。

另一方面，WS在工程菌株中異源表達后，可通過代謝工程與合成生物學手段對宿主進行改造，通過改變前體調整合成的酯類化合物成分。例如，通過在工程菌中異源表達脂肪酰基還原酶，提供不同的脂肪醇前體，可以合成各種各樣的蠟酯；通過組合不同來源的WS和不同來源的FAR，能夠生產出種類更多的酯類化合物[52]。調節生物體內自身的脂肪酸組成也有助于生產不同種類的蠟酯，已經發現抑制本氏煙草(Nicotianabenthamiana)的KASII基因表達可以改變C16和C18?；孜锏谋壤瑥亩淖儺a生的蠟酯種類[53]，這一思路可能對微生物生產不同種類蠟酯具有啟發作用。

目前，利用工程菌株生產蠟酯的產量仍然沒有達到工業化水平，其主要原因之一是脂肪酸或脂肪醇前體供應不足，常用的工業化菌株E.coli和S.cerevisiae自身的前體積累能力難以滿足大量蠟酯的生產[45]。通過引入異源脂肪酸生產途徑、敲除脂質的競爭途徑等手段可以在一定程度上提高蠟酯的產量[37-38,41,45,50],這些方法在產量優化的思路上占據主導地位。另外，尋找其他適合蠟酯生產的工程菌株，例如脂質積累能力比E.coli和S.cerevisiae更強的產油酵母[46]具有良好的應用前景，目前報道的脂肪酸乙酯產量最高的工程菌株為非模式產油酵母Y.lipolytica[48]。