miR-204抑制感染幽門螺桿菌的胃上皮細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制研究

王婷婷，朱曉軒，裴小紅

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)904醫(yī)院蘇州院區(qū)消化內(nèi)科，江蘇 蘇州 215000

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是最常見的人類病原體之一，它定植在全球約50%人口的胃壁上皮。H.pylori感染是引起胃萎縮和癌變的重要因素[1]。H.pylori被世界衛(wèi)生組織列為I類致癌物，研究已經(jīng)證實(shí)了H.pylori與胃癌之間的關(guān)系[2]。此外，研究發(fā)現(xiàn)H.pylori與胃癌轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)，也有研究發(fā)現(xiàn)H.pylori會(huì)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[3]。最新研究顯示,H.pylori會(huì)影響胃上皮細(xì)胞間的黏附，引起上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithlial mesenchymal transition, EMT)，破壞胃黏膜屏障，但其具體影響機(jī)制尚不清楚[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，這種功能是通過特異性的與靶基因的信使RNA結(jié)合(message RNA，mRNA)誘導(dǎo)mRNA降解和翻譯抑制，并且在調(diào)控胃癌細(xì)胞遷移和侵襲中起到重要作用，miR-204可通過直接靶向EMT相關(guān)蛋白發(fā)揮抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用[5]。本文主要分析H.pylori對(duì)胃上皮細(xì)胞遷移和侵襲的影響以及miR-204在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器人胃上皮細(xì)胞(GES1)和H.pylori(#26695)購自美國ATCC公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。miR-204類似物(mimic)以及相應(yīng)的陰性對(duì)照(negative control，NC)購自美國Thermo Fisher公司(#MC11116)。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting Kit-8，CCK-8)試劑盒購自中國Beyotime生物技術(shù)研究所。Transwell小室以及基質(zhì)凝膠購自美國BD Biosciences公司。PCR引物購自中國Genewiz公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒購自瑞士Roche公司。ABI 7500 PCR檢測系統(tǒng)購自美國Life Technology公司。RIPA裂解緩沖液購自中國Beyotime公司。anti-E-cadherin(#ab1416)、anti-N-cadherin(ab18203)、anti-Vimentin(ab92547)、GAPDH(ab181602)以及對(duì)應(yīng)的二抗購自美國Abcam公司。PVDF膜購自美國Bio-Rad公司。BCA蛋白測定試劑盒和ECL試劑盒購自中國Applygen公司。IX71顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組將GES1細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，相對(duì)濕度100%。將細(xì)胞分為3組，即對(duì)照組、H.pylori組和H.pylori+mimic組。

1.3H.pylori感染H.pylori組和H.pylori+mimic組細(xì)胞與H.pylori進(jìn)行共培養(yǎng)。將GES1細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁生長至80%，倒出培養(yǎng)基，按照H.pylori與GES1細(xì)胞100∶1的比例進(jìn)行共培養(yǎng)7 d，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2。感染后使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染H.pylori+mimic組細(xì)胞在與H.pylori共培養(yǎng)之前轉(zhuǎn)染miR-204 mimic。使用Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，對(duì)照組和H.pylori組細(xì)胞轉(zhuǎn)染等量的NC作為對(duì)照，在轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 qPCR實(shí)驗(yàn)通過Trizol獲得細(xì)胞中總RNA，然后檢測RNA的純度和濃度。使用cDNA試劑盒將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(42 ℃，60 min，70 ℃，5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)(反應(yīng)條件如下：95 ℃，10 min，60 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，延伸，-20 ℃保存)。U6作為miRNA的內(nèi)參，通過比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)分析miR-204的表達(dá)。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測遷移能力將細(xì)胞消化后分別接種在6孔板中，每孔1×106個(gè)，然后在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2、相對(duì)濕度100%條件下培養(yǎng)直至90%匯合。然后使用200 μl移液槍頭從上至下做劃痕，將劃掉的細(xì)胞洗去。然后在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。使用倒置顯微鏡觀察并獲得圖像，測量細(xì)胞前緣移動(dòng)距離的百分比(兩端前緣移動(dòng)距離/劃痕寬度×100%)。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測侵襲能力在Transwell小室的上室加入基質(zhì)膠，底室加入完全培養(yǎng)基，然后將3×104個(gè)細(xì)胞加入至上室培養(yǎng)48 h。48 h后洗去未侵入底室的細(xì)胞。然后將細(xì)胞使用20%甲醇固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色。在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野侵入底部室的細(xì)胞數(shù)目。

1.8 Western blotting檢測EMT相關(guān)蛋白在液氮下將細(xì)胞研磨，在液氮保護(hù)下使用RIPA裂解緩沖液裂解，并使用BCA蛋白測定試劑盒測量總蛋白含量。然后使用SDS-PAGE分離等量的總蛋白(120 V下電泳90 min)，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(50 V，120 min)，在含有質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂牛奶的封閉溶液中封閉。然后將PDVF膜與E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體(1∶500稀釋)在4 ℃孵育過夜，然后加入1∶5 000稀釋的HRP偶聯(lián)二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL試劑盒可視化蛋白條帶，并使用ImagePD軟件使用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)蛋白條帶的灰度進(jìn)行定量。

2 結(jié)果

2.1 感染H.pylori對(duì)GES1細(xì)胞miR-204的影響通過顯微鏡可觀察到感染H.pylori后的GES1細(xì)胞，且感染H.pylori后細(xì)胞邊界不清晰(見圖1)。根據(jù)qPCR的檢測結(jié)果，感染H.pylori后，GES1細(xì)胞中的miR-204水平比正常GES1細(xì)胞顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.962，P=0.000)。

圖1 顯微鏡觀察與H.pylori共培養(yǎng)后GES1細(xì)胞形態(tài)(100×)

2.2 各組細(xì)胞中miR-204水平H.pylori組的miR-204水平為0.36±0.04，顯著低于對(duì)照組的1.00±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);H.pylori+mimic組的miR-204水平為5.86±0.39，顯著高于對(duì)照組和H.pylori組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較H.pylori組的細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；H.pylori+mimic組的遷移和侵襲能力顯著低于H.pylori組(P<0.05)(見表1、圖2～3)。

表1 各組劃痕前沿遷移百分比和侵襲細(xì)胞數(shù)目比較Tab 1 Comparison of scratch front migration percentage and number of invading cells in each group

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測H.pylori和miR-204 mimic對(duì)GES1細(xì)胞遷移能力的影響(100×)Fig 2 Cell scratch test to detect the effects of H.pylori and miR-204 mimic on the migration ability of GES1 cells (100×)

圖3 Transwell檢測H.pylori和miR-204 mimic對(duì)GES1細(xì)胞侵襲能力的影響(200×)

2.4 各組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較H.pylori組的E-cadherin蛋白顯著高于對(duì)照組而N-cadherin蛋白和Vimentin 蛋白顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。H.pylori+mimic組的E-cadherin蛋白顯著低于H.pylori組而N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白顯著高于H.pylori組(P<0.05)(見表2、圖4)。

表2 各組E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平比較

圖4 Western blotting檢測各組EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

H.pylori在胃中很常見，由于其無法被宿主機(jī)體清除，一旦感染且未通過抗生素根除，則會(huì)在整個(gè)生命周期中持續(xù)存在。其中，有10%～15%的感染個(gè)體會(huì)發(fā)展為嚴(yán)重的胃病，這主要取決于細(xì)菌表達(dá)的致病性、毒力因子、環(huán)境因素和個(gè)體遺傳易感性。在健康個(gè)體中，胃上皮是抵抗病原體有效的第一道屏障，機(jī)體可通過調(diào)節(jié)胃上皮細(xì)胞的形狀、極性、細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與基質(zhì)的黏附力，保持胃屏障的完整性，并起到隔絕病原體的作用[6]。H.pylori伴隨著胃黏液定植，會(huì)影響胃上皮屏障功能，并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和腫瘤樣改變。

H.pylori會(huì)影響胃上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括增殖、凋亡、遷移、侵襲等，H.pylori介導(dǎo)的胃上皮細(xì)胞的遷移和侵襲是一個(gè)極其復(fù)雜的協(xié)調(diào)過程，其可通過多個(gè)途徑使細(xì)胞邊緣的層狀脂膜擴(kuò)展，改變細(xì)胞外基質(zhì)，并使細(xì)胞粘連減少，引起細(xì)胞的遷移和侵襲。且H.pylori也可能通過促進(jìn)血管生成引起胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[7]。研究發(fā)現(xiàn)，H.pylori的細(xì)胞毒素相關(guān)基因E可能通過TGF-β1促進(jìn)人胃癌細(xì)胞AGS和MKN45的遷移和侵襲，并促進(jìn)EMT[8]。miR在H.pylori調(diào)控的胃上皮細(xì)胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用，如miR-30可能通過抑制自噬途徑的多種核心蛋白促進(jìn)H.pylori在胃上皮細(xì)胞中的活性[9]。Zhou等[10]的研究顯示，H.pylori感染后會(huì)通過調(diào)控長鏈非編碼RNA AF147447調(diào)節(jié)miR-34c的表達(dá)，從而參與胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本次研究中首次發(fā)現(xiàn)將GES1細(xì)胞與H.pylori共培養(yǎng)后miR-204的水平顯著降低。miR-204與胃癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，在胃癌細(xì)胞中，H.pylori感染會(huì)使細(xì)胞中miR-204的水平降低從而促進(jìn)遷移和侵襲[11]。Shi等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-204的降低會(huì)促進(jìn)H.pylori引起的胃癌進(jìn)展。而本次研究在胃上皮細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了H.pylori會(huì)抑制miR-204的表達(dá)。

miR-204是一種具有抑癌作用的miRNA，如在肝細(xì)胞癌、宮頸癌和前列腺癌中，miR-204均發(fā)揮著抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用[13-15]。本次研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，將GES1細(xì)胞與H.pylori共培養(yǎng)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，且過表達(dá)miR-204會(huì)逆轉(zhuǎn)H.pylori對(duì)遷移和侵襲的促進(jìn)作用。此外，本次研究還發(fā)現(xiàn)H.pylori組的E-cadherin蛋白顯著高于對(duì)照組，而N-cadherin和Vimentin蛋白顯著低于對(duì)照組，H.pylori+mimic組的E-cadherin顯著低于H.pylori組而N-cadherin和Vimentin顯著高于H.pylori組。E-cadherin維持細(xì)胞之間的緊密連接，是上皮表型的標(biāo)志蛋白之一，N-cadherin和Vimentin是細(xì)胞上皮特征喪失及其轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)特征的標(biāo)志。此外，研究發(fā)現(xiàn)，miR-204會(huì)抑制食管癌細(xì)胞的EMT過程。在肺腺癌、乳腺癌中miR-204也具有這種作用[17-18]。本次研究提示在胃上皮細(xì)胞中，miR-204也具有抑制由H.pylori引起的EMT。

綜上所述，將胃上皮細(xì)胞與H.pylori共培養(yǎng)會(huì)使細(xì)胞中miR-204的水平降低，且過表達(dá)miR-204會(huì)通過調(diào)節(jié)EMT抑制由H.pylori引起的胃上皮細(xì)胞遷移和侵襲。但關(guān)于miR-204在H.pylori引起的胃上皮細(xì)胞遷移和侵襲中的作用還需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其作用機(jī)制也值得進(jìn)一步探討。