加減駐景方對脈絡膜新生血管動物模型TLR-4、NF-κB 和IL-6 表達的影響

陶方方，亢澤峰，陳水齡，褚文麗，劉健，周志豪

脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）是年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）、病理性近視、中心性滲出性脈絡膜視網膜病變、眼組織胞漿菌病、眼底血管樣條紋等疾病共同的終末病理環節[1]。CNV 的形成是多種細胞與多種因子共同作用的結果，近年來，白細胞介素-6（interleukin 6,IL-6）被發現與CNV 形成也有密切的關系，AMD 患者IL-6 表達較正常人有顯著升高，且疾病嚴重程度與IL-6 表達水平相關[2]。加減駐景方是亢澤峰教授治療AMD 和病理性近視等伴有CNV 眼底疾病的經驗用方，臨床治療有效，其作用機制尚不清晰，本研究采用組織學和分子生物學技術檢測CNV 動物模型中核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）信號通路相關因子活性，探討ToLL樣受體-4（ToLL-like receptor,TLR-4）/NF-κB/IL-6信號通路在CNV 形成中的作用，從而揭示加減駐景方抑制CNV 的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡雄性SPF 級BN 大鼠138 只，體重180～220 g，購買于北京市維通利華公司。動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。實驗前，適應性飼養3 d。

1.2 試劑與儀器

PCR 儀（Biometra,TProfessional ThermoCycler），全自動熒光定量PCR 儀（7500,ABI）。SP-9000 試劑盒（中杉金橋），NF-κB（Cell Signaling Technology），TLR-4、IL-6（Abcam），cDNA 第一鏈合成試劑盒（K1622,Thermo Scientific）。

1.3 實驗分組與給藥

大鼠任一眼為實驗眼，行激光造模，每只眼光凝8～10 個點。激光功率360 mW，光斑直徑50 μm，曝光時間0.05 s。按隨機數字表法將造模成功的大鼠分為模型組、中藥組、西藥組、聯合組，各30 只。空白組18 只大鼠，正常飼養，不做特殊處理。

模型組：光凝后第1 d 予生理鹽水灌胃，每日1次，共21 d。

中藥組：光凝后第1 d 予中藥灌胃，每日1 次，共21 d。中藥加減駐景方由楮實子、枸杞子、菟絲子、五味子、茺蔚子、三七粉、桂枝、茯苓、三棱、郁金、生黃芪和當歸等多種藥物組成，每劑中藥155 g，灌胃量10 ml/kg。

西藥組：光凝后第1 d 予玻璃體腔注射康柏西普（Conbercept），共計1 次。康柏西普，成都康弘藥業，規格10 mg/ml。5 μl 微量注射器玻璃體腔注射，1次，5 μl。

聯合組：光凝后第1 d 予中藥灌胃（同中藥組），每日1 次，共21 d，光凝后第1 d 予玻璃體腔注射康柏西普（同西藥組），共計1 次。

1.4 免疫組織化學法檢測TLR-4、NF-κB、IL-6

模型組和各治療組在光凝后第7 d、14 d、21 d各處死6 只大鼠取材。空白組在光凝后21 d 處死取材。制作組織切片，行免疫組織化學染色。石蠟切片脫蠟至水；PBS 洗滌5 min，3 次；抗原修復；3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶活性，10 min；1% Triton-100，室溫1 h;試劑A，室溫30 min；滴加稀釋后的一抗，陰性對照用PBS 溶液代替，4°C 過夜；試劑B，室溫下孵育30 min；試劑C，室溫下孵育10 min；DAB染色；自來水沖洗，蘇木素復染1 min，鹽酸酒精分化30 s，氨水返藍30 s；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干；光學顯微鏡拍攝照片。一抗稀釋倍數，TLR-4，1：200；NF-κB，1：100；IL-6，1：200。

每組選取15 張包含CNV 的免疫組化圖像，Image Pro Plus 6.0 軟件分析圖像的平均光密度值（average optical density,AOD）值作為半定量測定陽性表達物的依據。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測TLR-4、NF-κB、IL-6 mRNA 表達

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）技術，光凝后21 d，每組各處死6 只大鼠獲取眼杯，參照試劑盒方法用Trizol 一步法裂解組織，提取總RNA，按照試劑盒說明書，合成cDNA。配制反應體系如下：RealMasterMix 和SYBR 混合物10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl，超純水定容至20μl，進行PCR 循環，95℃預變性10min；95℃變性20s、60℃退火30s、68℃延伸60s；循環40 次。引物由北京科悅達生物科技有限公司合成。

用空白組目的基因與內參GAPDH 的相對表達量進行校正，得到空白組目的基因mRNA 相對表達量為1 時，實驗組目的基因mRNA 表達量是空白組的倍數。將2-ΔΔCt 視為各目的基因mRNA 的相對表達量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.6 蛋白免疫印跡法檢測TLR-4、NF-κB、IL-6 蛋白

采用蛋白免疫印跡（western blotting）技術檢測目的蛋白表達，光凝后21 d，每組各處死6 只大鼠獲取眼杯，獲取蛋白質樣品，測定總蛋白濃度，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，起始電壓設定為80 V，當樣品進入分離膠時，調整電壓至120 V，繼續電泳，直至溴酚藍跑至底部時，結束電泳。轉膜；5%脫脂牛奶封閉，室溫搖床孵育2 h；一抗4℃孵育過夜；1：5000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育1h；顯影液顯影。

使用Quantity One 分析軟件測定條帶光密度值，以GAPDH 條帶的光密度值校正，目的蛋白的相對表達量以目的基因條帶的光密度值與GAPDH 條帶的光密度值之比來表示。

1.7 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 21.0 進行數據分析。計量資料以平均數±標準差（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用方差分析中LSD-t 檢驗。當P＜0.05 時，則認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學結果

2.1.1 TLR-4 空白組大鼠視網膜組織中可見TLR-4 表達，視網膜神經節細胞層、內核層可見少量陽性反應物。模型組和各治療組CNV 組織中可見黃棕色陽性反應物，TLR-4 呈陽性表達。模型組TLR-4 表達量在光凝后14 d 時最大，21 d 時顯著減少，有統計學意義（P＜0.05）。各治療組TLR-4 表達量在光凝后7 d 時最大，隨后減少，有統計學意義（P＜0.05）。

光凝后7 d、14 d 與21 d，各治療組TLR-4 表達量均低于模型組。光凝后7 d 與21 d，聯合組TLR-4表達量最低，中藥組次之，中藥組TLR-4 表達量低于西藥組。光凝后14 d，西藥組TLR-4 表達量高于中藥組和聯合組，中藥組和聯合組之間無明顯差異。（表2、3，圖1）。

表2 光凝后不同時間各組TLR-4 的AOD 值變化（，n=15）

表2 光凝后不同時間各組TLR-4 的AOD 值變化（，n=15）

注：※ 與同時間段模型組比較，P＜0.05；# 與同時間段中藥組比較，P＜0.05；&與同時間段西藥組比較，P＜0.05；* 與同時間段聯合組比較，P＜0.05

表3 光凝后不同時間各組TLR-4 的AOD 值比較統計值

2.1.2 NF-κB 空白組大鼠視網膜組織中可見NF-κB表達，視網膜神經節細胞層可見少量陽性反應物。模型組和各治療組CNV 組織中可見大量黃棕色陽性反應物，NF-κB 呈強陽性表達。模型組NF-κB 表達量在光凝后14 d 最大（P＜0.05），21 d 時變化不明顯。各治療組NF-κB 表達量在光凝后7 d 最大，聯合組隨后無明顯變化，中藥組和西藥組21 d 時減少（P＜0.05）。

光凝后7 d、14 d 與21 d，各治療組NF-κB 表達量均低于模型組。光凝后7 d，聯合組NF-κB 表達量低于西藥組和中藥組，西藥組和中藥組之間無明顯差異。光凝后14 d，聯合組NF-κB 表達量最低，中藥組次之，中藥組NF-κB 表達量低于西藥組。光凝后21 d，聯合組和中藥組NF-κB 表達量均低于西藥組，聯合組和中藥組之間無明顯差異（表4、5，圖2）。

表4 光凝后不同時間各組NF-κB 的AOD 值變化（，n=15）

表4 光凝后不同時間各組NF-κB 的AOD 值變化（，n=15）

注：※ 與同時間段模型組比較，P＜0.05；# 與同時間段中藥組比較，P＜0.05；&與同時間段西藥組比較，P＜0.05；* 與同時間段聯合組比較，P＜0.05

2.1.3 IL-6 空白組大鼠視網膜組織中可見IL-6 表達，視網膜神經節細胞層可見少量陽性反應物。模型組和各治療組CNV 組織中可見大量黃棕色陽性反應物，IL-6 呈強陽性表達。模型組IL-6 表達量在光凝后14 d 最大，21 d 時逐漸減少（P＜0.05）。各治療組IL-6 表達量在光凝后7 d 最大，中藥組在光凝后14 d 開始逐漸減少，西藥組和聯合組在光凝后21 d減少（P＜0.05）。

光凝后7 d，中藥組和聯合組IL-6 表達量均低于模型組，聯合組IL-6 表達量低于西藥組，其余組間無明顯差異。光凝后14 d，各治療組IL-6 表達量均低于模型組，聯合組IL-6 表達量低于西藥組和中藥組，而中藥組與西藥組之間無顯著差異。光凝后21 d，各治療組IL-6 表達量均低于模型組，中藥組與聯合組IL-6 表達量無明顯差異，均低于西藥組（表6、7，圖3）。

圖1 TLR-4 免疫組化圖像（DAB 染色，×400）。1A 空白組，正常BN 大鼠視網膜組織中TLR-4 呈陽性表達；1B 模型組7 d；1C 中藥組7 d；1D中藥組21 d；1E 西藥組7 d；1F 西藥組21 d；1G 聯合組7 d；1H 聯合組21 d。模型組和各治療組CNV 中TLR-4 呈陽性表達（箭頭）

圖2 NF-κB 免疫組化圖像（DAB 染色，×400）。2A 空白組，正常BN 大鼠視網膜組織中NF-κB 呈陽性表達；2B 模型組7 d；2C 中藥組7 d；2D中藥組21 d；2E 西藥組7 d；2F 西藥組21 d；2G 聯合組7 d；2H 聯合組21 d。模型組和各治療組CNV 中NF-κB 呈強陽性表達（箭頭）

表5 光凝后不同時間各組NF-κB 的AOD 值比較統計值

表6 光凝后不同時間各組IL-6 的AOD 值變化（，n=15）

表6 光凝后不同時間各組IL-6 的AOD 值變化（，n=15）

注：※ 與同時間段模型組比較，P＜0.05；# 與同時間段中藥組比較，P＜0.05；&與同時間段西藥組比較，P＜0.05；* 與同時間段聯合組比較，P＜0.05

表7 光凝后不同時間各組IL-6 的AOD 值比較統計值

2.2 RT-qPCR 檢測TLR-4、NF-κB、IL-6 mRNA 相對表達量

模型組與各治療組各目的基因mRNA 相對表達量較空白組均有明顯增多，各治療組目的基因mRNA 相對表達量均低于模型組。各治療組NF-κB mRNA 相對表達量由高到低依次為中藥組、西藥組和聯合組。TLR-4 mRNA 相對表達量聯合組最低，西藥組與中藥組無明顯差異。IL-6 mRNA 相對表達量中藥組最低，西藥組與聯合組無明顯差異（表8、9）。

表8 TLR-4、NF-κB 與IL-6 mRNA 相對表達量（，n=9）

表8 TLR-4、NF-κB 與IL-6 mRNA 相對表達量（，n=9）

注：※ 與模型組比較，P＜0.05；# 與中藥組比較，P＜0.05；&與西藥組比較，P＜0.05；* 與聯合組比較，P＜0.05

表9 TLR-4、NF-κB 與IL-6 mRNA 比較統計值

2.3 Western blotting 檢測檢測TLR-4、NF-κB、IL-6蛋白相對表達量

圖3 IL-6 免疫組化圖像（DAB 染色，×400）。3A 空白組，正常BN 大鼠視網膜組織中IL-6 呈陽性表達；3B 模型組7 d；3C 中藥組7 d；3D 中藥組21 d；3E 西藥組7 d；3F 西藥組21 d；3G 聯合組7 d；3H 聯合組21 d。模型組和各治療組CNV 中IL-6 呈強陽性表達（箭頭）

模型組和治療組各目的蛋白相對表達量較空白組均有明顯增多，各治療組目的蛋白相對表達量均低于模型組。TLR-4 蛋白相對表達量西藥組較高，中藥組與聯合組無明顯差異。NF-κB 蛋白相對表達量中藥組較高，西藥組與聯合組無明顯差異。IL-6蛋白相對表達量中藥組較低，西藥組與聯合組無明顯差異（表10、11，圖4）。

表10 TLR-4、NF-κB 與IL-6 蛋白相對表達量（，n=9）

表10 TLR-4、NF-κB 與IL-6 蛋白相對表達量（，n=9）

注：Δ 與空白組比較，P＜0.05；※ 與模型組比較，P＜0.05；# 與中藥組比較，P＜0.05；&與西藥組比較，P＜0.05；* 與聯合組比較，P＜0.05

表11 TLR-4、NF-κB 與IL-6 蛋白相對表達量比較統計值

圖4 Western blotting 圖像

3 討論

3.1 TLR-4/ NF-κB/IL-6 信號通路調控CNV 形成的機制

缺氧和炎癥反應可以誘導內皮細胞表達IL-6，IL-6 是一種間接的促血管生成因子[3]，誘導眼內新生血管生成[4]。濕性AMD 患者房水中IL-6 的表達量與CNV 大小、黃斑中心厚度、黃斑容積有關[5-6]。激光誘導的CNV 模型中，抑制IL-6 可以下調血管內皮生長因子（vascular endothelium growth factor,VEGF）的表達，并且降低CNV 的大小[7]。激光誘導的鼠類CNV 模型是一種高水平的炎癥模型[8]，本研究中模型組IL-6 蛋白和mRNA 表達量較空白組有顯著增強。

IL-6 除了可以反饋性激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,PKB,AKT）/雷帕霉素靶蛋白(mammal target of rapamycin,mTOR) 信號通路和PI3K/AKT/NF-κB 信號通路[9]，上調VEGF 表達促進血管新生以外，還可以通過自分泌的形式作用于被炎癥因子激活的內皮細胞，誘導內皮細胞的增殖與遷移，直接促進血管生成[10]。

TLR-4/NF-κB 是細胞內重要的炎癥信號通路之一，可以調控下游炎癥因子IL-6 mRNA 的轉錄活性。TLR-4 在內皮細胞、中性粒細胞和單核巨噬細胞等細胞上有大量表達，TLR-4 識別胞外的革蘭陰性菌脂多糖、熱休克蛋白等物質，再經過髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor88,MyD88) 依賴性、非依賴性途徑激活NF-κB。NF-κB 是哺乳動物細胞中的一種轉錄因子，通過與下游靶基因DNA 結合，發揮轉錄激活的功能。

本研究中，模型組表達的TLR-4、NF-κB、IL-6蛋白及mRNA 較空白組均有顯著增強。氪激光誘導的BN 大鼠CNV 模型中，TLR-4/ NF-κB/IL-6 信號通路的激活促進了CNV 的生成。

3.2 加減駐景方抑制CNV 的可能機制

亢澤峰教授將AMD 歸為中醫眼科“瞳神絡病”的范疇[11]，認為本病的病機主要為肝腎不足，兼具氣血津液功能障礙，表現為瘀、痰、濕的本虛標實證，治以補腎明目、活血通絡為要則，輔以利水滲濕、止血活血、益氣養血、溫陽通絡之藥。因此，組成了以“補腎明目、益氣活血、化瘀通絡”為治則的加減駐景方。

既往實驗研究證實，加減駐景方具有抑制實驗性CNV 的作用[12-13]，這可能與方中多種藥物的抗炎利水、溫陽通絡作用有關。藥理學研究發現菟絲子、桂枝、茯苓具有抗炎[14]、利尿[15-16]、抗脂質過氧化及抗衰老等藥理學作用，具有改善實驗性心肌缺血的病變程度與范圍、增加冠狀動脈血流量與降低血管阻力的作用[17]。菟絲子性平、味辛甘，其滋補肝腎有陰陽雙補之功效，溫而不燥、補而不滯，益精明目。茯苓味甘，有滲濕健脾之效。桂枝性溫、味甘辛，有溫中補虛、健脾利水、溫陽通脈的功效。

3.3 中西醫結合治療CNV 的優勢

本研究中，TLR-4/ NF-κB/IL-6 信號通路的激活促進了實驗性CNV 的形成。中藥組、西藥組和聯合組均有抑制CNV 的作用，其中聯合組的抑制作用最強。高表達的VEGF 具有通過正反饋調節進一步激活PI3K/AKT 信號通路的作用，各治療組通過對VEGF 表達的抑制，理論上可以抑制這一正反饋調節作用。TLR-4/NF-κB 通過激活IL-6，促進新生血管生成；激活的IL-6 又可以正性調控PI3K/AKT 信號通路的激活。中藥組對IL-6 的表達具有顯著的抑制作用，且效果優于西藥組和聯合組，加減駐景方可能通過降低IL-6 的表達，進一步降低了PI3K/AKT信號通路的激活。加減駐景方可能通過多靶點，發揮了抑制CNV 的作用。有研究發現，玻璃體腔注藥術所導致的纖維化可以造成體內IL-6 水平的升高[18]，在本研究中，RT-qPCR 與Western blotting 的結果顯示西藥組與聯合組的IL-6 表達量均高于中藥組，這或許與玻璃體腔注射操作有關。

本研究中，各治療組均有抑制TLR-4/NF-κB/IL-6 信號通路活性的作用。加減駐景方通過降低TLR-4/ NF-κB/IL-6 信號通路活性，發揮了抑制CNV 形成的作用，這可能與方藥中多種藥物的抗炎作用有關。