小麥種質GLM 1701藍粒性狀的遺傳定位分析

彭 琴， 周 軍， 徐如宏， 何 方， 任明見

(貴州大學農學院/國家小麥改良中心貴州分中心， 貴陽 550025)

藍粒小麥作為糊粉層中富含藍色花青素的特色小麥種質，與普通小麥相比， 含有較高的蛋白質和賴氨酸，銅、鐵、錳、鋅4種有色微量元素，且具有很強的抗氧化性[1-4]。高建偉等研究發現，藍粒小麥的籽粒藍色常常與許多優良的農藝性狀連鎖[5]；Li Z S等經過連鎖遺傳分析發現，粗桿、寬葉、直葉、深綠色及半冬性等許多農藝性狀與藍色胚乳性狀密切相關[6]。Jia Y.等發現，藍色花青素只在大麥、小麥和黑麥中積累，而且小麥族藍色籽粒是一個新的性狀，最近才進化出來[7]。目前藍粒性狀已被用作理論研究和小麥育種中的遺傳標記，用于測量雜交頻率，鑒定真正的雜種，并監測染色體變化[8-13]。

藍粒小麥籽粒之所以呈現藍色，是由于其糊粉層中含有藍色色素，使種子呈深藍色，呈現胚乳直感、顯性遺傳，并具有明顯的劑量效應[14]。國內外學者對控制藍粒性狀的遺傳規律展開了大量研究，但是不同來源的藍粒小麥控制籽粒色素基因數目等基因源問題還存在爭議。相志國等研究表明，藍粒在遺傳過程中有母本效應，類似一對基因控制的遺傳行為，藍粒性狀基因的表達有明顯的劑量效應，相同的藍粒基因在與小麥中不同的染色體發生代換，其效應完全不同[15]；同一基因控制著的藍粒可劃分為深、中、淺三類，在不同的環境條件下種植，也表現出一定的差別[16]。黃碧光等研究表明，藍粒的遺傳受1對基因控制，藍粒為顯性，且控制藍粒的基因具有劑量效應[17]。Hurd等認為，藍粒受2個互補的不完全顯性基因控制[18]；Keppenne等認為，藍粒受2對呈抑制互作的基因控制[19]。蘭素缺等研究發現，來源于偃麥草的D 87065和D 87089的籽粒色素基因由2對互補基因控制；來源于黑麥的92-1由2對互補基因控制；來源不明確的7083 L-16由1對基因控制[20]。目前已經定位的小麥藍色糊粉層基因有來自長穗堰麥草的4 AgL染色體的Bal基因[21]，來源于百薩堰麥草的BaThb位于4 JL[22]；來源于栽培一粒和野生一粒的Ba2位于4 AL[23-24]；還未定名的，源于中間偃麥草，位于4 J(FL 0.60-1.00)[25]。

BSA(Bulked Segregant Analysis)稱為混合群體分離分析法，是一種通過極端性狀進行功能基因挖掘的方法。該方法是用合適的分子標記對2個基因池進行分析，在2個基因池間存在多態性的標記與目標性狀的基因座連鎖[26-27]。BSA雖然SSR標記具有高可靠性、穩定性和良好重復性的優點，但是它們在基因定位中與BSA(例如RAPD，AFLP，SSR)結合使用有許多分子標記，它們對某種變化具有特異性。對基因進行靶向定位仍然是耗時且勞動密集的，并且難以同時進行大量料或靶基因的大規模定位篩選。隨著DNA測序技術的發展，SNP標記被發現且廣泛用于構建動物和植物遺傳連鎖圖譜，SNP標記具有數量多，密度高，遺傳穩定性高，易于自動檢測等優點。因此，SNP正在迅速取代傳統標記，例如RFLP和SSR。BSA+基因芯片方法可以快速檢測2種不同表型之間的遺傳差異[28-29]。SNP突變及其染色體片段比全基因組基因定位更準確。目前很多研究者通過這種方法完成了許多基因的定位，趙秋實等[30]通過BSA法結合660 K基因芯片以及SSR分子標記技術成功將矮桿基因定位于1 A染色體上。蔣宏寶等[31]利用BSA法結合小麥660 K基因芯片將小麥葉綠素缺失突變體B 23定位于7 AL染色體上。

GLM 1701是貴州大學農學院國家小麥改良中心貴州分中心通過遠緣復合雜交創制的藍粒小麥新種質。本研究通過常規雜交構建遺傳群體結合660 K基因芯片技術進行遺傳分析和基因定位，以期為合理有效地利用藍粒小麥新種質GLM 1701提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料為GLM 1701(藍粒)、貴農19(白粒)、貴農麥30號(白粒)、中燕96-3(白粒)和綿麥301(白粒)，均由貴州大學農學院國家小麥改良中心貴州分中心提供，并在該中心試驗地種植。

1.2 遺傳群體構建

藍粒小麥品種GLM 1701分別與白粒小麥品種貴農19號、貴農麥30號、中燕96-3和綿麥301進行正反雜交構建F1群體，將收獲的F1世代夏播加代繁殖，對F1世代群體單株進行套袋自交，構建F2分離群體，于2018年11月將F2群體種植在貴州大學教學實驗場國家小麥改良中心貴州分中心小麥育種科研基地，于2019年3月底3葉時進行單株編號，待長到4～5葉時，每單株取1～2片葉備提取DNA，構建F2∶3群體，5月份按單株收獲，并進行單株粒色統計。

1.3 遺傳分析

將收獲的全部F1，BC1F1、F2中群體中不能區分的藍色籽粒和籽粒橫切成兩半，含胚的一半用來繼續種植，另一半用來觀察糊粉層顏色，統計F1、BC1F1、F2群體各個組合藍粒、白粒比例。

1.4 基因定位及群體驗證

根據F3單株粒色結果，在貴農19×GLM 1701組合中選取F2純藍粒和純白粒各40個單株葉片分別組建顏色性狀混池，利用賈繼增等與Affymetrix聯合研發的660 K基因芯片對2個親本和BSA混池進行SNP基因分型，這部分工作主要在北京博奧生物技術有限公司完成。

根據芯片結果，對貴農19×GLM 1701組合雙親及混池進行篩選，找出具有多態性的標記對其F2∶3群體進行基因定位和驗證。單株葉片DNA提取參照徐如宏等[32]改良的CTAB法提取基因組。PCR反應體系為10 μL：模板DNA(100 ng·μL-1)2.0 μL、primer(10 μmol·L-1)1.0 μL、TagE(5 U·μl-1)0.1 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)0.2 μL、10×Buffer(Mg2+)(5 mmol·L-1)1.2 μL、ddH2O 4.5 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min， 50～60 ℃(根據不同引物決定)退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。 PCR擴增產物采用8%的非變性的聚丙烯酰胺凝膠，銀染法檢測。顯影后，在白熾燈下觀察電泳結果，進行條帶統計和照相。

2 結果與分析

2.1 遺傳群體籽粒顏色性狀的表現

利用藍粒小麥種質(GLM 1701)與白粒小麥品種(貴農19號、貴農30號、中燕96-3、綿麥301)作為親本，分別組配正反交F1、F2和BC1F1群體，對各個群體籽粒顏色性狀進行觀察統計(表1)。

表1 相關世代群體籽粒顏色性狀的表現

由表1可知，F1世代籽粒顏色深淺與藍粒親本作為父本或母本有關，當藍粒親本GLM 1701作為母本時，F1籽粒顏色表現為中藍色，當藍粒親本GLM 1701作為父本時，F1籽粒顏色表現為淺藍色，說明藍粒為顯性，存在劑量效應。正反交F2世代籽粒的顏色均表現出藍白粒分離；回交中正反交F1與白粒親本進行正反回交，BC1F1都是出現藍粒和白粒，正反交F1與藍粒親本進行正反回交，BC1F1只有藍粒。結果表明，GLM 1701的藍粒性狀為顯性性狀，且存在劑量效應。

2.2 遺傳群體F2代群體籽粒顏色的分析

利用GLM 1701與貴農19號、貴農30號、中燕96-3、綿麥301進行正反交，調查統計其正反交F2群體的籽粒顏色，通過卡方檢驗分析藍粒與白粒的分離比例(表2)。

表2 F2代群體籽粒顏色的分離情況

由表2可知，各雜交組合F2發生藍粒和白粒的分離，且藍粒與非藍粒的數目相當，分離比例為5∶4，藍粒有深淺之分，體現劑量效應。

2.3 遺傳群體BC1F1群體籽粒顏色的分析

利用GLM 1701與綿麥301、貴農30號、中燕96-3和貴農19號進行正反交構建F1群體，正反交F1再與雙親進行正反回交，調查統計其回交群體BC1F1的籽粒顏色(表3)。

圖1GLM 1701藍粒性狀胚乳基因的遺傳模式

由表3可知，正反交F1與白粒親本進行正反回交，BC1F1代群體藍粒∶白粒為1∶2，正反交F1與GLM 1701進行正反回交，BC1F1代群體全為藍粒。

表3 BC1F1代群體籽粒顏色的分離情況

2.4 F2分離比例的驗證

綜合回交群體分析表明，當正反交F1作為母本與白粒親本回交時，BC1F1群體藍粒與白粒的比例都是1∶2，說明含藍粒基因的配子約占雌配子總數的33%，而理論上含藍粒基因的雄配子占雌配子總數的50%，因此藍粒基因通過雌配子的傳遞率約為67%(33%/50%)。同樣當正反交F1作為父本與白粒親本回交，BC1F1群體藍粒與白粒的比例同是1∶2，說明藍粒基因通過雌配子的傳遞率也約為67%(33%/50%)。綜合分析得出，含藍粒基因的配子約占雌或雄配子總數的33%，傳遞率均只有67%。

因含藍粒基因的雌、雄配子的傳遞率降低，造成了F2藍粒與非藍粒的比例失真，不符合正常的孟德爾遺傳，根據測交結果得出的藍粒基因雌雄傳遞率推算F1產生2種配子在雌雄配子中的比例，據此可算出F2代各種類型的比例。用A表示藍粒基因，a表示非藍粒基因，藍粒是由2 n的極核與n的精細胞結合而形成的三倍體胚乳糊粉層性狀，所以用AA和aa分別表示2種雌配子，三核胚乳的基因型有4種：AAA、AAa、Aaa和aaa。從表4可看出，在F2中，A_∶aa，即藍粒∶非藍粒=(1+2+2)∶4 =5∶4，理論上藍粒在F2中的比例為56%，非藍粒為44%。這與實際中F2非藍粒與藍粒數目相當的情況相吻合。各組合F2藍粒與非藍粒的比例通過卡方驗證p>0.5(表2)。說明正是含藍粒基因雌雄配子傳遞率的下降，造成F2藍與非藍粒比例不符合3∶1。綜合自交F2和回交BC1F1得出，GLM 1701的藍粒性狀是由一對主效基因控制。

表4 F1代2種配子在雌雄配子中的比例與F2代4種胚乳基因型的理論比例

假設藍粒小麥種質GLM 1701胚乳的基因型為AAA，白粒小麥品種貴農30號和貴農19號胚乳的基因型為aaa，其胚乳遺傳模式如圖1所示。

2.5 藍粒基因定位及驗證

2.5.1SNP芯片測序結果分析

運用小麥660 K基因芯片分別對貴農19×Glm 1701組合2個極端混池以及雙親進行全基因組檢測。將在2個混池以及雙親間均表現差異的SNP進行比較整合，基于質控后獲得2個混池及2個親本間共同表現差異的SNP共有301個。根據660 K芯片遺傳整合圖譜信息，將表現出差異的SNP整合到小麥21條染色體上(圖2)。由圖2可知，1 A、3 A、1 B、3 B、5 D五條染色體上沒有差異SNP，4 D染色體上差異SNP分布達到205個，約占總SNP的68%；4 B、4 A和6 D染色體上分別分布13個差異SNP，5 A染色體上分布26個差異SNP，約占總SNP的22%，其余的差異SNP分散分布在其他染色體。推測控制藍粒性狀的基因位于4 D染色體上。

圖2 差異SNP的染色體分布

注：Maker為100 bp DNA Ladder，1～48為F2群體里藍粒單株，目標條帶位置為194 bp左右。

注：Maker為100 bp DNA Ladder，1～48為F2群體里白粒單株。

2.5.2基因定位及群體驗證

根據芯片結果選用位于4 D染色體上[33-34]的58對標記對貴農19×GLM 1701組合雙親及混池進行篩選，發現Xgwm 165標記能在雙親和混池中有差異。

將特異性標記Xgwm 165對貴農19×GLM 1701正反交F2群體進行PCR分析，所獲結果見表5。根據表5數據，用軟件Joinmap 4.0計算，Xgwm 165標記與GLM 1701遺傳距離為5.8 cM。此結果證明控制GLM 1701藍粒性狀的基因位于4 D染色體。

表5 群體交換單株統計

同時，用其他各個組合的F2∶3群體對標記Xgwm 165進行驗證，部分結果見圖3、圖4。在后代材料的檢測中，除其中1株未擴增出目標條帶，其它均能擴增出194 bp目標條帶，與F2粒色統計結果基本一致，說明標記Xgwm 165與藍粒基因是連鎖的。

2.5.3特性標記Xgwm 165定位

對特異性標記Xgwm 165的PCR產物進行T載體克隆，在成都擎科生物技術有限公司完成。克隆得到Xgwm 165的序列為：TGCAGTGGTCAGAGTTTTCCCAGGCCACAGATGAGCAAAAGAAATCTTTTGTTGTCCAGCGTTGTCTAATCTTGCCTTGCGAATAGTACTTTTGAGCAGCTCAAGGAGAGAGAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGAGCGCGCGCGCAAACAAAGATAGCAAAGAATTAGGCAACACTGGCGCAATCTGAAAGAAAAG，基于JBrowse網站(網址：http:202.194.139.32/jbrowse)，比對中國春(IWGSC reference V1.0 all Chromosomes)版本，得到標記Xgwm 165在4 D染色體上的位置為412716481～412716679 Mb。

3 討 論

藍粒小麥的籽粒之所以表現出藍色特性，主要原因是其籽粒的胚乳糊粉層中富含花色素[34-35]。胚乳是由1個精核(n)與2個極核(n+n)受精結合為胚乳核(三倍體)，然后發育成胚乳。藍粒親本與白粒親本雜交，F1均為中藍(藍粒小麥作為母本)或淺藍色(藍粒小麥作為父本)[16]。籽粒顏色深淺通過表型觀察誤差較大，所以本研究對藍粒小麥的籽粒進行橫切，含胚的一半繼續種植，另外一半用來觀察糊粉層顏色。

本研究以藍粒小麥種質GLM 1701分別與白粒小麥品種貴農19號、貴農30號、中燕96-3和綿麥301進行正反交及正反回交，對籽粒糊粉層顏色的觀察統計表明，F1籽粒顏色與李振聲等[16]的研究結果一致；正反交F2世代藍粒與白粒的比例為5∶4；正反交F1與白粒親本進行正反回交，BC1F1群體中出現藍粒∶白粒為1∶2的比例，正反交F1與藍粒親本進行正反回交，BC1F1群體則全為藍粒，綜合分析BC1F1群體和對自交F2群體的驗證，發現含藍粒基因的雌雄配子的傳遞率分別只有67%，因此造成自交F2和回交群體BC1F1偏離正常的孟德爾遺傳，通過F1、F2和BC1F1世代群體遺傳規律分析得出GLM 1701藍粒性狀的基因是一對基因控制，與李振聲等[16]、黃碧光等[17]、蘭素缺等[20]和Knievel等[36]的研究結果一致。有所不同的是，黃碧光等研究得出，含藍粒基因的雌配子傳遞正常，而雄配子的傳遞率只有20%，自交F2為11∶9的比例。Knott等研究發現，雌蕊功能表現為正常的情況下，攜帶偃麥草染色體的花粉功能弱于不攜帶偃麥草的染色體的花粉[37]。傅體華等也認為，含藍粒基因的配子傳遞率會下降[ 38]；Keppenne等認為，F2符合1∶2∶1的特點[19]。控制藍粒性狀的染色體由于種間雜交可能被群體分離成碎片或含有整個供體親本染色體，且與小麥中不同的染色體發生代換，其效應完全不同[7,15,37]，且由于花粉直感和環境變化的影響，以及其他一些不確定因素影響藍粒小麥藍粒顏色的表型，導致藍色種子表面形成條紋或斑點，干擾了對藍粒性狀的觀察統計，從而導致出現不同的研究結果。除此之外，藍粒基因的表達還會受到其他基因的影響[39-42]。

利用BSA混池法結合660 K基因芯片能夠快速和高效地進行目標基因的定位。本試驗中芯片結果顯示，控制藍粒性狀的基因位于4 D染色體，不同于之前的研究結果，可能是一個新的基因，且篩選到一個特異性標記Xgwm 165，位于4 D染色體的長臂上，遺傳距離為5.8 cM，本研究將控制藍粒性狀的基因命名為LM1。對Xgwm 165標記進行T載體克隆，比對中國春得到的物理位置為412716481～412716679 Mb。此結果可為GLM 1701藍粒小麥的進一步利用提供基礎。