PGPR菌劑在蜈蚣草修復砷污染土壤中的應用研究

袁明

摘 ? ?要：為研究PGPR菌劑對蜈蚣草修復砷污染土壤的作用，采用盆栽進行試驗，在砷濃度150 mg/kg的土壤中接種PGPR菌劑，再培養蜈蚣草。研究結果表明，接種PGPR菌劑后可以促進蜈蚣草生長，土壤中總砷含量減少，顯示PGPR菌劑對蜈蚣草修復砷污染土壤具有促進作用。

關鍵詞：蜈蚣草;PGPR菌劑;砷污染土壤;修復

文章編號：1005-2690（2021）23-0022-04 ? ? ? 中國圖書分類號：X53 ? ? ? 文獻標志碼：B

PGPR是植物根際促生菌，可以促進植物生長及植物對礦物質營養的吸收和利用，是能抑制有害微生物生長的有益菌類。本研究采用蜈蚣草的盆栽試驗，在蜈蚣草根際施用PGPR菌劑，探討各種PGPR菌劑對蜈蚣草砷超富集能力的影響，得到蜈蚣草與PGPR菌劑共同作用下對砷污染土壤修復效率的理論依據。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 盆栽試驗

將長勢相近的33株蜈蚣草種植于白色塑料花盆中，每個花盆中的土樣為2.2 kg，每日澆清水，前一個月每周澆灌一次植物營養液，每盆20 mL。為保持溫度和濕度，在盆口包上一層保鮮膜。每個花盆中加入亞砷酸鈉，使土壤中砷含量為150 mg/kg。花盆編號1～11號，做3組平行試驗。

1.2 ? 菌株接種

利用試驗前期從蜈蚣草根部分離篩選獲得的具有抗病促生功能的耐砷內生細菌作為PGPR菌劑[1]，包括芽孢桿菌、農桿菌、假單胞菌3種類群共12株。基于12株菌株的抗病促生能力和拮抗特性進行組合，形成PGPR菌劑（具體組合情況見表1），共10組，編號T1～T10。把菌株接種于無菌牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于30 ℃恒溫振蕩培養72 h（活菌數≥1×108 cfu/mL）。采用澆灌的方式將T1～T10號PGPR菌劑接種于蜈蚣草根部。每一個月重復加一次菌懸液，總共澆灌4次。以不加菌劑為空白對照（CK）。

1.3 ? 植物收樣

蜈蚣草放入光照培養室培養6個月后，將蜈蚣草從花盆中移出，沖洗干凈表面的土壤，移出時避免傷害根莖，然后分開保存根系和地上部[2]。

1.4 ? 植株生長情況測定

①測定蜈蚣草株高：從露出土壤表面的地方測定每根莖的最高點。②測定蜈蚣草葉片總數。③測定莖粗。④測定鮮重、干重。測定完鮮重后將樣品在115 ℃殺菌0.5 h，然后75 ℃恒溫烘干后稱重。⑤將蜈蚣草地上部與根系分離，用LA-S植物圖像分析儀對根系進行洗根分析，得到掃描分析后的根系數據與圖片。

1.5 ? 葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性測定

（1）酶液提取。稱取蜈蚣草葉片0.25 g放入研缽中，加入50 mmol/L、4 ℃、pH值8.2的磷酸緩沖溶液，在水浴鍋中研磨成漿，過濾后將濾液在4 000 r/min下離心20 min，取上清液為待測液。

（2）超氧化物歧化酶（SOD）活性測定方法。使用鄰苯三酚自氧化法。將50 mmol/L、pH值8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖溶液和50 mmol/L鄰苯三酚溶液放在恒溫水浴鍋中，溫度設定25 ℃。待溫度保持穩定后取3 mL Tris-HCl-EDTA緩沖溶液、5μL鄰苯三酚溶液加入試管中，搖勻后迅速放入比色皿中，在紫外分光光度計中測定吸光度，波長325 nm，每間隔30 s測定一次吸光度，記為A1，此為不加酶液的對照組。

重復上述操作，待Tris-HCl-EDTA緩沖溶液、鄰苯三酚溶液混勻后迅速加入5 μL待測液，同樣在波長325 nm處每隔30 s測定一次吸光度，記為A2。

（3）計算抑制率S（%）和酶活力性U（U/g）。

式中：V為反應液總體積（mL）;N為樣品稀釋倍數。

1.6 ? 葉片中過氧化物酶（POD）活性測定

（1）酶液提取。稱取0.2 g蜈蚣草葉片，然后加入20 mmol/L磷酸緩沖液5 mL，在研缽中研磨成勻漿，轉入試管中并以磷酸緩沖液定容到10 mL，以4 000 r/min離心10 min，取上清液為待測酶液。

（2）反應混合液配制。取0.2 ?mol/L磷酸緩沖液（pH值6.0）200 mL加入0.076 mL愈創木酚攪拌溶解，冷卻后加入30%的H2O2 0.112 mL，混勻后保存于冰箱中備用。

（3）測定方法。取3 mL反應混合液加入30 μL酶液，以0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH值6.0）為對照調零，而后測定OD470值（測定40 s），每30 s讀數一次。

（4）酶活性計算。以每分鐘OD值變化（升高）0.01為1個酶活性單位。計算酶活性U（U/g）。

式中：Vt為提取酶液總體積（mL）;Vs為測定時取用酶體積（mL）;W為樣品鮮重（g）;t為反應時間（min）。

1.7 ? 數據處理

試驗使用Excel 2010軟件對原始數據進行處理和分析，利用SPSS 17.0計算Duncan單因素方差。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 蜈蚣草生物量參數

蜈蚣草生物量參數，株高、葉片數、莖粗、鮮重、干重見表2。

試驗中，接種T1、T9、T10號組合PGPR菌劑的蜈蚣草與空白對照相比，蜈蚣草的植株高度、莖粗、干鮮重、葉片數都出現了一定程度的增加。接種T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號組合PGPR菌劑的蜈蚣草，上述生物量參數出現了一定程度的減少，蜈蚣草生長受到了明顯抑制，株高、莖粗、鮮重、干重、葉片數都低于空白對照組。蜈蚣草接種不同PGPR菌劑的生長情況見圖1。

2.2 ? 抗氧化酶系統

蜈蚣草超氧化物歧化酶與過氧化物酶的活性見表3。

2.3 ? 蜈蚣草洗根分析

蜈蚣草的洗根分析如圖2所示，分析數據如表4所示。對比空白對照組接種T1、T9、T10號PGPR菌劑的蜈蚣草根系的總根長、根表面積、根平均直徑都有一定程度的增加，T1植株根系平均直徑增長量最大。接種T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號組合PGPR菌劑的蜈蚣草根系總長度、表面積、平均直徑都有一定程度的減少。

2.4 ? 土壤理化性質分析

土壤理化性質如表5所示。11組土壤都為酸性，對比空白對照組可知，施加PGPR菌劑會略微增加土壤的酸性。施加T1、T9、T10號PGPR菌劑還會增加土壤的有機質、速效氮、有效磷、速效鉀含量。

由表5可知，土壤中的總砷含量有所降低，說明土壤中的砷部分轉移到蜈蚣草地上部。與空白對照組相比，添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的土壤中砷含量更低，T1、T9、T10號蜈蚣草從土壤中吸收的砷更多，對土壤中砷的去除效率分別提高了36.36%、9.10%、18.18%。其中，T1號菌劑的效果最好，說明施加PGPR菌劑確實可以提高蜈蚣草對砷污染土壤的修復效果。

2.5 ? 土壤總砷含量與蜈蚣草各項生理指標的相關性分析

通過對土壤總砷含量和蜈蚣草各項生理指標進行相關性分析，采用SPSS中的雙變量相關性分析方法，結果如表6所示。其中，蜈蚣草株高、葉片數、鮮重、干重、根平均直徑與土壤中總砷顯著負相關，即與蜈蚣草對砷的吸收量顯著正相關。

3 ? 討論

3.1 ? 接種不同PGPR菌劑對蜈蚣草生長情況的影響

對比不加菌劑的空白對照，添加T1、T9、T10號PGPR菌劑可以促進蜈蚣草生長，提高蜈蚣草的生物量，具體表現在蜈蚣草的株高、干鮮重、葉片數、莖粗都有明顯增加。這可能是因為添加PGPR菌劑能夠緩解砷對蜈蚣草的毒性，使蜈蚣草在砷脅迫環境下也能正常生長。添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號PGPR菌劑的蜈蚣草生長受到抑制，上述各項生物量參數下降。

3.2 ? 接種不同PGPR菌劑對蜈蚣草抗氧化酶活性的影響

添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的蜈蚣草葉片的SOD、POD酶活性都比空白對照組高，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號PGPR菌劑的蜈蚣草SOD酶和POD酶活性都比空白對照組低。SOD酶和POD酶是蜈蚣草體內很重要的抗氧化酶。

研究表明，蜈蚣草在砷脅迫的環境下，會產生有毒害作用的自由基，而SOD酶可以清除有毒害的自由基，緩解砷對植物的毒害作用，POD酶能分解SOD酶作用產生的過氧化氫，消除過氧化氫對植物的氧化作用[3]。接種T1、T9、T10號PGPR菌劑能夠促進蜈蚣草生長，提高蜈蚣草生物量的原因可能是T1、T9、T10號PGPR菌劑提高了蜈蚣草的SOD、POD酶活性，緩解了砷脅迫環境對蜈蚣草的毒害作用，相反T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號蜈蚣草生長受到抑制，可能是由于對應的PGPR菌劑能會抑制SOD、POD酶活性。

3.3 ? 接種不同PGPR菌劑對蜈蚣草根系形態的影響

對比空白對照組，添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的蜈蚣草根系總根長、根表面積、根平均直徑都有一定程度的增加，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號PGPR菌劑的蜈蚣草根系總根長、根表面積、根平均直徑都有所下降。本試驗中添加的PGPR菌劑對蜈蚣草根系的生長特性有所改變，其中T1、T9、T10號PGPR菌劑提高了蜈蚣草根系長度、表面積與直徑，增大了根系與土壤的接觸面積，有利于蜈蚣草從土壤中吸收砷。添加T1、T9、T10號PGPR菌劑能促進蜈蚣草生長、提高植株生物量，可能是因為PGPR菌劑引起蜈蚣草根系形態改變，提高根系體積與活力，可以更好地吸收土壤中的營養物質[4]。

3.4 ? 蜈蚣草生長情況與PGPR菌劑中的菌株組合方式的關系

添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的蜈蚣草生長情況優于空白對照組，蜈蚣草的株高、干鮮重、葉片數、莖粗都有明顯增加，根系總根長、根表面積、根平均直徑也有一定程度的增加。根據表1中菌株的組合方式發現，T1、T9、T10號PGPR菌劑中都有芽孢桿菌A，其余生長受到抑制的蜈蚣草中都沒有接種含有芽孢桿菌A的PGPR菌劑。研究發現，芽孢桿菌有抑制病原菌生長、幫助植物提高免疫力、分泌植物激素的能力。因此，芽孢桿菌A對促進蜈蚣草生長、進一步提高砷修復有潛在價值。

3.5 ? 接種不同PGPR菌劑對土壤理化性質的影響

試驗中11組土壤都呈酸性，添加PGPR菌劑會使土壤的pH值略微下降。研究表明，蜈蚣草對酸性環境有很高的耐受性，能夠在酸性很強的土壤中生長，并且在酸性條件下對砷的吸收能力更強[5]。本試驗中添加PGPR菌劑，對土壤pH值的改變不明顯，對蜈蚣草砷吸收能力沒有影響。

添加T1、T9、T10號PGPR菌劑會增加土壤中的有機質、有效磷、速效氮、速效鉀含量。研究表明，微生物通過降解、合成等各種活動可以提高土壤中的有機質和各種營養成分，導致土壤理化性質改變。

11組土壤中的砷濃度都有所降低，低于最初未種植蜈蚣草時的濃度（150 mg/kg）。添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的土壤中砷濃度低于空白對照組，添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號PGPR菌劑的土壤中砷濃度高于空白對照組。這說明添加T1、T9、T10號菌劑的蜈蚣草砷吸收能力增強，對土壤砷修復效果增強，其中，T1號PGPR效果最好。這可能是因為添加PGPR菌劑能夠促進蜈蚣草生長，提高了植株生物總量，而更大的生物量意味著相同環境能富集到更多的砷。T1、T9、T10號蜈蚣草根系總長、根表面積、根平均直徑增加，能幫助蜈蚣草富集到更多砷。

4 ? 結論

通過試驗可知，接種T1、T9、T10號PGPR菌劑對蜈蚣草地上部及根系的生長有促進作用，并能提高蜈蚣草修復土壤砷污染的效果，減少土壤中的總砷含量。本試驗表明，PGPR菌劑在促進蜈蚣草修復砷污染土壤方面具有潛在價值。

參考文獻：

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