龍牙百合組織培養技術體系的優化

陳海霞 王登輝 王茯苓 王建國

摘? ? 要：為降低龍牙百合組培苗生產成本，本試驗以其種球鱗片為外植體，研究誘導、不定芽增殖和生根階段的優化技術方案。結果表明：百合鱗片上端為最佳外植體，不定芽誘導率最高;不定芽初代誘導培養的最佳培養基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA，分化率高達到93%，分化系數為7.43;不定芽增殖培養的最佳培養基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1 NAA，其增殖系數高達到6.7;瓶內生根培養最佳培養基為1/2MS++0.1 mg·L-1 NAA，其生根率達93.33%，瓶外生根培養時發現，采用濃度為300 mg·L-1 NAA溶液處理后，在河沙基質中生根率為100%，平均根系數量高達8.6 ，根長達到5.2 cm。上述結果可為龍牙百合的快速和高效繁殖提供參考依據。

關鍵詞：龍牙百合;組織培養;初代誘導培養;增殖培養;生根培養

中圖分類號：S664.1? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.12.002

Optimization of Tissue Culture Technology System of Lilium brownii var. viridulum

CHEN Haixia1，WANG Denghui1，WANG Fuling1， WANG Jianguo2

（1.College of Horticulture， Hunan Agricultural University，Changsha， Hunan 410128， China; 2. The Planting professional cooperative of Bletilla in Hongjiang， Huaihua， Hunan 418100， China）

Abstract： In order to reduce the production cost of tissue culture seedlings of Lilium brownii var. viridulum， the experiment used bulb scales as explants，and the optimized technical schemes for different cultivation stages were studied. The results showed that the upper end of lily scales was the best explant， and its adventitious bud induction rate was the highest.The optimum medium formula for the primary induction culture of adventitious buds was MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA， which the differentiation rate was up to 93%， and the differentiation coefficient was 7.43.The optimum medium formula for adventitious bud proliferation culture was MS+1.0 mg·L-1 6-BA +0.1 mg·L-1NAA， and its proliferation coefficient was up to 6.7.The optimum medium formula for in-bottle rooting culture was 1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA， and its rooting rate reached by 93.33%. When rooting culture outside the bottle，it was found that the rooting rate was 100%， the average growth root coefficient was up to 8.6， and the root length reached by 5.2 cm in the river sand substrate after treatment with 300 mg·L-1 NAA solution. These results could provide a reference for the rapid and efficient reproduction of Lily.

Key words： Lilium brownii var. viridulum; tissue culture; primary induction culture; proliferation culture; rooting culture

龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）是百合科百合屬多年生草本球根植物，是我國人工栽培的三大食用百合之一，具有重要的食用、藥用和觀賞價值[1-2]，其鱗莖由二三十瓣重疊在一起，鱗片肥大呈披針形，因形似龍牙而得名[3]。湖南邵陽、隆回縣以及江西萬載縣為龍牙百合的主要產地。龍牙百合病毒病感染嚴重，多年的無性繁殖造成病毒病積累和品種退化，嚴重影響食用百合產業的發展。因此，近年來圍繞龍牙百合組織培養脫毒技術開展大量研究，并獲得無病毒苗。由于生產成本高，食用百合脫病毒技術尚未應用于產業中，本研究擬建立高效率低成本的組培繁育體系，推進無病毒百合種苗的應用。

組培苗生產成本的降低主要從培養基成分、多途徑節能降耗、組培過程自動化、加強環境質量等方面著手[4]。張春芬等[5]為降低草莓脫毒組培苗的生產成本，用白砂糖代替蔗糖，用卡拉膠代替瓊脂粉，總成本降為原來的32.5%。謝文申等[6]用淺層液體培養與固體培養基相比，可節約成本57.44%，同時減少大量用工。張恒[7]為降低草莓脫毒苗的生產成本，將傳統組織培養模式中壯苗培養、生根培養合并為壯苗生根一步，通過組培模式的改進，每株草莓試管苗成本可降低31.9%。早在1994年，日本三菱重工開發出針對百合的鱗莖繼代培養開發自動化作業系統，日本Kirin Brewery公司成功應用叢生狀組培苗的自動化系統[8]。

本試驗開展龍牙百合組織培養技術體系的優化研究，以期為龍牙百合的產業化降低成本，促進無毒百合苗產業的工廠化、規模化和標準化生產。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum），2018年7月采集于湖南省懷化市洪江市白芨藥材種植專業合作社的龍牙百合生產基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒與選擇 以龍牙百合商品球為外植體，將種球從外至里剝下鱗片，均放在1 L的大燒杯中，自來水下流水沖洗泥土30 min，之后用蒸餾水洗10 min，再投入0.1%HgCl2中消毒10 min，用無菌水沖洗3～5次，每次沖洗5 min，最后使用滅菌的濾紙吸干鱗片表面的水分。將消毒的鱗片從中部切開，分成上下兩段，并分別斜插至誘導培養基上，篩選適宜的外植體部品。

1.2.2 不定芽誘導培養 基本培養基為MS培養基，其中蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH 5.8，加入不同濃度的6-BA及NAA溶液，設計了6種培養基，如表1所示。每個處理接種30瓶，每瓶2個外植體，3次重復。百合組培苗生長的環境條件為每日16 h光/8 h暗培養，光照強度為1 500 lx，溫度為（26±2） ℃。30 d后統計分化率。誘導分化率（%）=分化數/外植體數×100;分化系數=不定芽分化總數/分化數。

1.2.3 不定芽增殖培養 經初代培養基誘導分化后，待不定芽高度達到1～2 cm時，將龍牙百合不定芽切割成單個的芽體，接種到增殖培養基上進行培養。基本培養基為MS培養基，其中蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，pH 5.8，加入不同濃度的6-BA及NAA溶液，設計了6種培養基，如表2所示。每個處理接種30瓶，每瓶2個不定芽，設3次重復，培養條件同1.2.2。30 d后統計增殖情況并做記錄。不定芽增殖系數=增殖芽體數/接種芽體數。

1.2.4 瓶內生根培養 待叢生芽高度生長至3 cm時，將長勢健壯的芽切下分成單個的小鱗莖，接種于不同NAA濃度的生根培養基上。每個處理接種30瓶，每瓶2個小鱗莖，3次重復，培養條件同1.2.2。30 d后統計生根率及生根系數。基本培養基為1/2MS培養基，添加不同濃度的NAA溶液，分別為0.1，0.2，0.3 mg·L-1 NAA，分別記為C1、C2和C3。

1.2.5 瓶外生根培養 瓶外生根法分別采用河沙和混合基質（珍珠巖∶蛭石∶泥炭土=1∶1∶1），無根苗移栽前，用0.1%～0.2%高錳酸鉀溶液對基質進行消毒，種植時表面噴灑多菌靈溶液再次進行消毒，覆膜保持適宜的濕度。當無根苗鱗莖直徑大于1 cm時，置于無強烈直射光的煉苗室內進行煉苗。煉苗4 d后，將組培苗從瓶內取出，洗凈殘留的培養基，在不同濃度的NAA的溶液（表3）中浸泡15 s左右，移栽到基質中。將其置于遮陰處，濕度控制在80%～90%，移栽溫度以20～25 ℃為宜。30 d后統計生根情況。

1.3 數據分析

采用Excel 2010進行數據整理，利用SPSS 21.0軟件對試驗數據進行方差分析，采用單因素方差分析各處理差異以P<0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同外植體對百合不定芽誘導的影響

由圖1-A～D可以看出，取材部位不同，不定芽的誘導率也不同。以上端鱗片為外植體，其不定芽的分化時間早，接種后10～20 d時，上端鱗片的不定芽生長速度快，且不定芽分化數量也多;鱗片接種40 d時，上端鱗片的不定芽發育完成，數量多且生長健壯，并開始抽生新葉。由圖1-E～H可以看出，下端鱗片不定芽發育速度慢和數量少，抽生的新葉呈淡綠色，葉片纖細。在同一激素水平下，分析龍牙百合鱗片取材部位與不定芽的分化率和分化系數的關系，結果（表4）表明，龍牙百合上端鱗片的分化率達到90%，分化系數高達6.33，均大于下端鱗片。綜合說明龍牙百合上端鱗片適合誘導培養。

2.2 激素對百合不定芽誘導的影響

激素種類和濃度也影響不定芽的誘導，以2.1篩選的外植體在含不同濃度及其配比NAA和6-BA的培養基中進行不定芽誘導，結果如圖2所示。在培養基A2和A6中百合幼苗纖弱，不定芽形成幼葉很快，并在基部長出新根;在A4和A5培養基中分化的不定芽數量最多，形成的小鱗莖鱗片肥厚，幼葉色澤濃綠。分析不同濃度及其配比的NAA和6-BA對龍牙百合不定芽的誘導效果有影響，結果（表5）表明，當NAA激素濃度不變時，隨著6-BA濃度的升高，小鱗莖的分化率及分化系數呈現先上升后下降的趨勢;當6-BA濃度不變時，高濃度的NAA更有利于不定芽的分化;A4培養基的不定芽誘導最高，分化率達到93%，分化系數為7.43，均顯著高于其他培養基。綜合說明，A4（MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA）培養基更適合龍牙百合不定芽的誘導。

2.3 不同濃度激素對百合不定芽增殖的影響

如圖3所示，不定芽接種在增殖培養基上40 d時，不同濃度激素對不定芽的增殖的影響表現為：培養基B3、B4、B5和B6中不定芽數量多，長勢旺盛;而B1和B2培養基中不定芽數量較少，葉色略有發黃;其中B3培養基中不定芽長勢旺盛，葉片寬大。分析不同濃度6-BA與NAA對龍牙百合不定芽增殖率的影響，結果（表6）表明，在相同NAA水平下，隨著6-BA濃度的升高，不定芽增殖系數先增加再下降;當6-BA濃度不變時，低濃度的NAA更有利于不定芽的增殖生長;其中B3培養基中龍牙百合不定芽的增殖系數最大為6.7，顯著高于除B1和B4外的其他培養基。綜合說明，龍牙百合最佳增殖培養基為B3，即MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1。2.4 不同濃度激素對百合生根培養的影響

2.4.1 瓶內生根 培養30 d后，不同培養基中百合組培苗根系生長情況如圖4所示，C1培養基中試管苗葉片生長粗壯且顏色翠綠，根系發達粗壯，數量多; C2培養基中百合根系較纖細;C3培養基中百合根系生長不整齊，顏色發黃。分析不同培養基龍牙百合的生根情況，結果（表7）表明，隨著培養基中NAA濃度的增加，百合生根數、株高及生根率均降低，根長有增加趨勢。綜上說明低濃度的NAA溶液（0.1 mg·L-1）有利于百合組培苗根系的生長。

2.4.2 瓶外生根 以河沙為培養基質時（圖5），隨著NAA溶液濃度的升高，百合根系的長度和新根數量逐步增加，可見河沙基質中NAA溶液有利于龍牙百合無根苗的瓶外生根培養。在混合基質中（圖6），隨著NAA溶液濃度的升高，百合新根的數量與長度在增長。通過比較兩種基質中試管苗的生長情況可知，在河沙中新葉發生數量少，根系生長勢強且數量多;在混合基質中，龍牙百合幼苗葉片數量多，且開展，地上部分生長速度明顯優于地下部分。

分析基質與激素對百合瓶外生根的影響，結果（表8）表明，以河沙為基質，龍牙百合無根苗生根速度快、根系數量多且粗壯，其表現優于混合基質;對無根苗進行NAA預處理發現，龍牙百合幼苗的根系生長情況與NAA濃度的增加成正比，發根數和新生根的長度均呈上升趨勢，當NAA濃度達到300 mg·L-1時，龍牙百合幼苗的根系最發達，根數為8.6條，根長為5.2 cm。

3 結論與討論

3.1 外植體的類型影響組培苗的生長

在百合離體培養過程中外植體有鱗片、花器官、葉片、莖段、種子等，其中鱗片最常用。潘佑找等[9]以蘭州百合的鱗片、葉片、根的不同部位為外植體進行植物組織培養，發現不同外植體分化能力存在差異，其差異由強到弱為：鱗片>根>葉片。羅鳳霞等[10]以新鐵炮百合葉片、花瓣、花絲、鱗片和種子為外植體進行組織培養再生研究，結果表明分化能力：種子>鱗片>花絲>花瓣>葉片。本試驗在前人研究的基礎上選擇鱗片作為外植體進行誘導，大大的降低了組培的污染率，提高了外植體誘導的成活率，減少了試驗材料的浪費;同時，試驗過程中發現，以龍牙百合鱗片的上端為外植體時，誘導率高達到90%，分化系數高達6.33，比鱗片下端更優，且分化時間短，不定芽生長健壯。

3.2 植物激素影響百合組培苗的生長

在百合的植物組織培養中，常用激素有NAA、2，4-D、IAA、IBA、BR、6-BA、KT、TDZ等。任峻和宋迎亞[11]研究表明，生長素類化學物質（如NAA、2，4-D等）有利于植物愈傷組織的形成，而細胞分裂素類化學物（6-BA、KT等）主要是促進細胞分裂或不定芽的分化。目前大多數常用的6-BA的濃度為0.4～2.0 mg·L-1，NAA常用濃度為0.1～0.5 mg·L-1[12]。本試驗將植物激素濃度設置在在常用濃度范圍內，有利于不定芽的分化與增殖。通過不同激素配比試驗發現，龍牙百合初代誘導培養基MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1NAA對不定芽誘導效果最好，與唐東芹[13]的研究結果相似。龍牙百合不定芽增殖最佳培養基配方為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1 NAA，與龐新霞[14]的研究結果一致。當6-BA濃度過高 （高于1.0 mg·L-1），芽增殖情況較差，且有大量愈傷組織出現，這與王剛等[15]試驗結果一致。在瓶內生根培養過程中，當NAA溶液濃度為0.1 mg·L-1時，百合根系的生長情況最好，這與王宏梅[16]的研究結果相似，即鐵炮百合添加NAA的處理其生根率與平均生根條數比添加IAA、IBA的處理都要多， 且NAA濃度為0.1～0.2 mg·L-1時根系生長情況好。

3.3 瓶外生根法降低組培苗的生產成本

瓶外生根法實質就是將無根試管苗直接移植至適宜的基質中培養。本試驗分別采用了河沙基質和混合基質，結果發現河沙基質的生根數量和根系長度都優于混合基質。百合適合生長在總孔隙度和通氣孔隙度大的土壤中，并且百合的根系屬于肉質根，而沙質土壤的透氣性、透水性都十分良好，十分適合龍牙百合根系的生長。混合基質的保水性很好，基質的表層出現輕微板結現象，易造成鱗莖腐爛，地下部分無法呼吸，從而導致植物死亡，這與百合扦插繁殖試驗結果[17]一致。本試驗還采用NAA對龍牙百合進行預處理，結果表明濃度為300 mg·L-1的NAA溶液，促進龍牙百合的生根和根系生長，這與藍莓組培苗瓶外生根試驗結果[18]相似。組培苗瓶外生根技術已在藍莓、草莓、甘蔗、八仙花、牡丹、梔子和蝴蝶蘭等園藝植物上成功運用[19]。有研究表明，瓶內生根法產生的單株試管苗生根成本比瓶外生根法產生的單株試管苗生根成本高51%[20]。究其原因是瓶內生根法操作環節多，對操作技術和環境要求高，且生長周期較長，占用室內空間大，耗能大;而瓶外生根法操作簡單，管理粗放。因此，瓶外生根法不僅有利于幼苗生長，而且節省了人力物力，降低生產成本，促進龍牙百合種苗高效、優質和低能耗生產。

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