根系分泌物對砷酸還原菌TS28活性及土壤中酶活性的影響

郭 平，徐富凱，劉亦博，李美璇，封保根，3，陳薇薇

(1. 吉林大學 新能源與環境學院，地下水資源與環境教育部重點實驗室，長春 130012；2. 吉林省水資源與水環境重點實驗室，長春 130021；3. 中國長江三峽集團有限公司 流域樞紐運行管理中心，湖北 宜昌 443000)

隨著工業化和城鎮化的快速推進, 我國現在面臨嚴重的土壤污染問題, 而重金屬污染是土壤污染中最重要的一方面[1]，其中砷(As)是最常見的重金屬污染物之一[2]. 近年來, As污染土壤的植物與微生物聯合修復, 因其具有生態友好性、 修復面積大以及成本低等優點已成為土壤污染修復領域的研究熱點. 因此, 揭示其修復機制具有實際意義.

無機砷酸鹽[As(Ⅴ)]和亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]是土壤中分布最廣的As化合物[3]. 將As(Ⅴ)還原為As(Ⅲ)可提高As的生物有效性, 有效促進植物對As的吸收富集[4]. 因此，研究人員將能還原As(Ⅴ)的外源砷酸還原菌(ARB)與As超積累植物或As富集植物聯合修復As污染土壤, 結果表明，外源砷酸還原菌可提高As超積累植物或者As富集植物對土壤As的修復效果[5-8]. 植物根系分泌物是根際環境中的重要物質, 其成分包括有機酸、 氨基酸、 糖類等[9]. 由于植物根系分泌物能影響土著根際細菌以及部分外源降解菌的存活[10-11]，因此，在As污染土壤的植物-微生物修復中, 外源ARB的存活也應受根系分泌物的影響. 但目前關于根系分泌物對外源ARB存活影響的信息較少, 而且在根系分泌物存在的情形下, ARB對As(Ⅴ)還原能力的影響仍未知. 此外, 酶活性可反映土壤肥力和土壤環境, 對植物-微生物修復的效果也有重要影響. 目前關于外源ARB對土壤酶活性影響的研究文獻報道較少. 根系分泌物存在下ARB的存活特征及其對As(Ⅴ)還原能力和土壤酶活性的影響是研究植物與外源ARB聯合修復As污染土壤的重要機制.

基于此, 本文以砷酸還原菌(Stenotrophomonassp.TS28)以及油菜、 小麥和小白菜產生的根系分泌物為實驗對象, 研究根系分泌物對As污染土壤中砷酸還原菌TS28存活、 As還原能力的影響以及土壤酶活性的變化規律，為植物與微生物聯合修復As污染土壤提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 供試土壤的采集與制備

實驗土壤取自吉林省某處農田未受As污染的表層(0～20 cm)黑土(記為NAs), 自然風干、 粉碎過2 mm篩網后儲藏備用. 實驗土壤的基本理化性質列于表1. 在實驗土壤中加入砷酸鈉溶液, 得到50 mg/kg的As污染土壤(記為As), 自然老化3個月, 風干, 粉碎過2 mm篩網后儲藏備用.

表1 供試土壤的基本理化性質Table 1 Basic physical-chemical characteristics of test soils

1.2 根系分泌物的提取

油菜、 小麥和小白菜種子購自吉林省農科院種子站, 表面消毒后在潮濕條件下萌發. 按文獻[12-14]方法從土壤中取出試管苗收集根系分泌物. 將收集的根系分泌物過0.45 μm濾膜, 過濾滅菌, 于-4 ℃儲存. 用總有機碳分析儀(TOC-5050A型, 日本島津公司)測定過濾后根系分泌物的質量濃度(以總有機碳質量濃度標定), 油菜、 小麥和小白菜根系分泌物的質量濃度分別為39.16,30.57,27.98 mg/L. 根據油菜根系分泌物的質量濃度確定本文中根系分泌物的研究質量濃度為39.16 mg/L[15].

1.3 菌株的標記與培養

選擇實驗菌株為具有As還原能力的細菌Stenotrophomonassp.TS28(由華中農業大學王革嬌教授惠贈). 將保存在-70 ℃的細菌接種到3 mL LB液體培養基(酵母膏5 g/L, 胰蛋白胨10 g/L, 氯化鈉5 g/L)中, 先在28 ℃, 250 r/min條件下培養25 h, 再在LB固體培養基中用0.1 g/L的利福平標記細菌[16]. 結果表明, 實驗土壤中除TS28外的細菌不能在含0.1 g/L利福平的LB固體培養基上培養, 即計算的菌落形成單位(CFU)均來源于標記的TS28. 同時, 標記菌的生長曲線和對As(Ⅴ)的還原能力保持不變. 將標記細菌接種到液體培養基中, 用去離子水稀釋, 制得接種劑(107CFU/mL, OD600nm=1).

1.4 細菌存活和As還原

分別將100 g的NAs和As土添加到塑料盆中, 每盆土壤按107CFU/g濃度接種, 標記為TS28, 實驗期間每盆土壤接種1次. 接種結束后, 為模擬根系分泌物的持續釋放, 每天添加根系分泌物至質量濃度為39.16 mg/kg, 共持續10 d. 將塑料盆轉移到25 ℃、 相對濕度為70%的恒溫培養箱中. 每24 h稱取2份2 g土壤樣品, 將1份土壤樣品與5.0 mL,w=0.1%的蛋白胨緩沖液充分混合, 渦旋20 s, 2次，用含有利福平的LB培養基進行涂板和菌落計數. 從另一份土壤樣品中提取As(Ⅲ)和As(Ⅴ), 用高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜法 (HPLC-HG-AFS, AFS-2202E型，北京海光儀器有限公司)分析測定[17]. 每種處理重復3次.

1.5 土壤酶活性測定

測定處理1，4，8 d土壤中酶的活性. 用靛酚藍比色法測定脲酶活性[18]; 用磷酸苯二鈉比色法測定酸性磷酸酶活性[19]; 用3,5-二硝基水楊酸比色法測定蔗糖酶活性[20]; 用對硝基苯磷酸二鈉法測定脫氫酶活性[19].

1.6 統計分析

細菌存活數量的下降率可表示細菌在一段時間內的存活狀態變化, 通過計算TS28存活數量的下降率分析其在培養時間內的存活能力. 下降率(η)的計算公式為

(1)

式中Nt為第t天的菌數,Nt+1為第(t+1)天的菌數.

lg(Nt/N0)=-(t/δ)p，

(2)

式中:t為培養時間(d);N0和Nt分別為0時刻和t時刻時的種群密度(CFU/mL);δ為細菌數第一次下降10倍所需時間;p為形狀參數,p<1生存曲線上凸,p>1生存曲線下凹,p=1表示線性生存曲線.

用SPSS軟件IBM SPSS Statistics 22.0處理數據, 所有圖形均用Origin 2019軟件繪制.

2 結果與討論

2.1 根系分泌物對As污染土壤中TS28存活的影響

圖1為As污染土壤中添加油菜、 小麥以及小白菜根系分泌物對砷酸還原菌TS28存活數量的影響. 由圖1可見, 無論是否存在As污染, 砷酸還原菌TS28的存活量均隨時間延長呈下降趨勢. 與對照土壤相比, As污染土壤中TS28的存活數量隨時間延長下降更快, 且二者呈顯著差異(P<0.05). 在第7天的As污染土壤中，TS28的存活量相比對照土壤降低了38.64%，與文獻[21-22]結果相似, 表明土壤中的As抑制了TS28的存活. 這是因為As(Ⅴ)作為一種磷酸鹽類似物, 可取代影響三磷酸腺苷(ATP)合成的無機磷, 從而干擾能量的產生、 碳代謝以及核酸合成, 進而抑制了細菌的存活, 導致細菌數量顯著下降[23].

圖1 根系分泌物存在下As污染 土壤中TS28的存活曲線Fig.1 Survival curves of TS28 in As contaminated soil in presence of root exudates

不同處理方法下As污染土壤中TS28的生存曲線擬合參數列于表2. 由表2可見, 添加不同根系分泌物后As污染土壤中TS28的δ=0.39～1.31. 表明在As污染土壤中添加不同根系分泌物導致TS28存活量降低一個數量級所用的時間不同, 可見不同根系分泌物對TS28存活的影響不同. 在根系分泌物存在下，TS28的p=0.60～1.06, 與As污染土壤存在差別. 表明添加根系分泌物后, As污染土壤中TS28存活曲線形狀發生了較大改變. 添加根系分泌物后，TS28的存活時間為5.88～6.16 d, 均高于As污染土壤. 表明3種根系分泌物均可延長TS28的存活時間, 且3種根系分泌物對TS28存活時間的延長效果相差較小.

由表2和圖1可見, 添加植物根系分泌物可刺激TS28的活性, 顯著提高TS28在As污染土壤中的存活數量并延長其存活時間. 在第7天的As污染土壤中, 添加油菜、 小麥以及小白菜根系分泌物的TS28存活量分別是未添加根系分泌物的246.41%，285.74%，286.17%, 存活時間分別延長了29.23%，34.95%，35.38%. 主要是因為植物根系分泌物中含有大量的有機成分, 可為細菌提供必要和豐富的營養[24], 從而提高了TS28數量. 由于初始細菌數會影響細菌存活率[25], 因此TS28存活數量的下降率可用于評估細菌存活能力隨培養時間的變化. 經計算, 在As污染土壤中添加油菜、 小麥和小白菜根系分泌物后, TS28的平均下降率分別為3.08%，3.00%，3.00%, 均低于不含根系分泌物As污染土壤中4.49%的下降率，且小白菜和小麥的根系分泌物比油菜的根系分泌物對TS28的活性有更強的促進作用.

表2 不同處理方法下As污染土壤中TS28的生存曲線擬合參數Table 2 Survival curve fitting parameters of TS28 in As contaminated soil under different treatments

2.2 根系分泌物對As污染土壤中As(Ⅴ)還原的影響

在As污染土壤中, 3種植物根系分泌物對TS28還原As(Ⅴ)的影響如圖2所示. 由圖2可見，在未添加TS28和根系分泌物的情形下, 土壤中的As(Ⅴ)在10 d內未被還原, 表明As污染土壤中的物質和微生物不能還原As(Ⅴ). 在添加TS28的As污染土壤中, As(Ⅲ)在土壤中的積累量隨時間的延長呈先增加后逐漸趨于穩定的趨勢. 前4 d, As(Ⅲ)的積累量達 8.84 mg/kg, 10 d內As(Ⅲ)的總積累量達10.03 mg/kg, 前4 d的還原量占總還原量的88.14%, 表明TS28可有效還原As(Ⅴ), 且As(Ⅴ)的還原主要發生在實驗前期. 這是由于實驗前期土壤中的TS28存活數量較大, 土壤中營養物質較多, 因此TS28對As(Ⅴ)的還原能力較強.

圖2 根系分泌物存在下TS28對As(Ⅴ)還原的影響Fig.2 Effects of TS28 on As(Ⅴ) reduction in presence of root exudates

2.3 根系分泌物對As污染土壤中酶活性的影響

土壤酶是土壤中最活躍的有機成分之一, 代表土壤物質旺盛的能量代謝, 是與土壤肥力和生態環境質量相關的重要生物學指標[28]. 根系分泌物和TS28對土壤中酶活性的影響如圖3所示. 由圖3可見, 與未受As污染土壤相比, 無論是否添加TS28或根系分泌物, As污染土壤中的脲酶、 脫氫酶、 磷酸酶和蔗糖酶的活性均隨時間延長而迅速下降, 表明As降低了土壤酶活性. 在僅含As污染土壤的處理組中，8 d內4種土壤酶活性分別下降67.42%，36.58%，32.62%，39.43%. 這可能是由于As與酶-底物復合物相互作用[29], 使酶蛋白變性或與蛋白活性基團相互作用降低了酶活性所致.

a. As純土壤； b. As+TS28； c. As+小白菜； d. As+小麥； e. As+油菜； f. As+TS28+小白菜； g. As+TS28+小麥； h. As+TS28+油菜； i. NAs純土壤； j. NAS+TS28； k. NAs+小白菜； l. NAs+小麥； m. NAs+油菜； n. NAs+TS28+小白菜； o. NAs+TS28+小麥； p. NAs+TS28+油菜. 圖3 根系分泌物和TS28對土壤中酶活性的影響Fig.3 Effects of root exudates and TS28 on enzyme activities in soil

TS28處理使土壤中蔗糖酶和脫氫酶活性下降, 相比于As土壤組, 土壤中蔗糖酶和脫氫酶活性在第8天分別下降27.67%，13.23%, 對其他土壤酶活性影響較小. 生物體內的大多數氧化還原反應是由氧化還原酶(如脫氫酶)催化的. 添加TS28削弱了可能產生脫氫酶和蔗糖酶的細菌的存活優勢, 從而抑制了這兩種酶的活性. 此外, TS28對As(Ⅲ)的積累可能增強了As對微生物的毒害作用, 進而抑制了這兩種酶的活性.

根系分泌物可緩解TS28和As對土壤酶的抑制, 增強酶活性. 與TS28處理組相比, 含有根系分泌物和TS28處理組的脲酶、 酸性磷酸酶、 蔗糖酶和脫氫酶的活性明顯升高，其中油菜根系分泌物增強土壤酶活性的效果最好. 這主要是由于脲酶、 酸性磷酸酶和蔗糖酶是參與土壤中碳、 氮、 磷養分轉化的幾種主要酶[29], 而含有這些營養素的根系分泌物可誘導微生物更多地產生和釋放這3種酶. 同時, 在土壤中對As脅迫耐性較強的細菌可能具有更強的利用碳、 氮、 磷養分的酶系統, 根系分泌物可刺激這些細菌分泌更多的酶抵抗脅迫. 此外, 由于脫氫酶在生物體內的能量供應中起重要作用, 因此, 根系分泌物可誘導生成脫氫酶的細菌產生更多的脫氫酶以抵抗As的脅迫. 根系分泌物中的有機碳可提高酶的抗分解能力和穩定性[9], 這可能也是根系分泌物提高脫氫酶活性的原因.

綜上, 根系分泌物、 TS28和As對土壤酶活性的影響因酶的類型不同而不同. 土壤中酶的活性是土壤微生物、 pH、 有機質、 營養元素、 重金屬等多種因素綜合作用的結果.

3 結 論

1) 油菜、 小麥和小白菜的根系分泌物改變了TS28的存活模式, 可促進TS28的活性，其中小白菜根系分泌物對TS28活性有更強的促進作用.

2) 3種根系分泌物對TS28還原As(Ⅴ)能力的影響不同： 油菜根系分泌物前期促進了TS28對As(Ⅴ)的還原； 小麥和小白菜的根系分泌物在整個實驗期間均不同程度地促進了As(Ⅴ)的還原； 3種根系分泌物中, 小麥根系分泌物的促進作用更強.

3) TS28降低了As污染土壤中蔗糖酶和脫氫酶的活性, 而對脲酶和磷酸酶活性幾乎無影響； 添加根系分泌物提高了含TS28的As污染土壤中4種酶的活性, 其中油菜根系分泌物的促進效果最好.