金黃色葡萄球菌腸毒素B對人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC的促進(jìn)作用及機(jī)制探討

肖楚麗，譚 瀟

（邵陽學(xué)院，湖南 邵陽 422000）

慢性鼻竇炎使得鼻黏膜黏液增加，纖毛的清除能力得以降低，從而導(dǎo)致黏液淤積，細(xì)菌滋生，進(jìn)而削弱黏液纖毛清除力，使其系統(tǒng)受到嚴(yán)重?fù)p傷，引發(fā)惡性循環(huán)[1]。黏蛋白存在于鼻腔及鼻竇黏液中，由鼻黏膜上皮杯狀細(xì)胞或杯狀細(xì)胞分泌而來，MUC5AC是氣道分泌物中主要的黏蛋白，其主要由杯狀細(xì)胞分泌，能濕化氣道，提高上皮細(xì)胞功能，其為抵御外界刺激的屏障，但人體如受病原體感染，或吸煙，黏蛋白的分泌量會(huì)增多。下面對金黃色葡萄球菌腸毒素B對人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC的促進(jìn)作用及機(jī)制進(jìn)行探究，具體研究內(nèi)容如下：

1 資料與方法

1.1 試劑

金黃色葡萄球菌腸毒素B購自Toxin Technolog，純度高于95%。胎牛血清及DMEM/Ham F12培養(yǎng)基從Hyclone購入。胰蛋白酶從Sigma-Adrich購入，MUC5AC ELISA檢測試劑盒由武漢華美生物工程有限公司購入，SB203580由Calbiochem購入，鼠抗人磷酸化p38抗體及total=p38抗體從Cell signaiing購入。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

本研究選取的鼻黏膜上皮細(xì)胞均為下鼻甲黏膜組織，標(biāo)本來自我院行鼻中隔手術(shù)的90例患者，研究前獲得患者的同意，并得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。患者均無鼻炎及哮喘疾病。手術(shù)獲取患者的下鼻甲標(biāo)本，將其置于磷酸鹽緩沖液中，其中含有100 IU/mL的青霉素及100 mg/L的鏈霉素，將其置于無菌條件下，反復(fù)沖洗，隨后置入5倍體積的胰蛋白酶中，將其放置在4℃環(huán)境下消化16～18 h。采用習(xí)慣吹打2 min，將脫落的上皮細(xì)胞收集起來，置入濃度2.5%的胎牛血清中，結(jié)束消化。進(jìn)行離心處理，調(diào)整到1000 rpm，離心5 min，收集完全培養(yǎng)基（DMEM/Ham F12培養(yǎng)基中含有10%的胎牛血清、100 IU/mL的青霉素及100 mg/L的鏈霉素），將細(xì)胞漂洗2次，接種在培養(yǎng)板上，并將鼻黏膜上皮細(xì)胞中的纖維細(xì)胞及紅細(xì)胞去除，將細(xì)胞置入37℃環(huán)境中，在5%濃度二氧化碳條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待其融合80%以后，將1 μg/L、10 μg/L及100 μg/L等濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B處理不同時(shí)間，用作下一步研究。

1.3 上清中MUC5AC分泌水平檢測

采用ELISA法檢測培育上清中的MUC5AC分泌水平，當(dāng)鼻黏膜上皮細(xì)胞達(dá)到80%～90%時(shí)，棄培養(yǎng)基，并將1 μg/L、10 μg/L及100 μg/L等濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B放置24 h，完成后，采用連續(xù)凍融方式，將細(xì)胞裂解，獲取裂解產(chǎn)物后，進(jìn)行離心處理，調(diào)整到1000 rpm離心5 min，取血清進(jìn)行MUC5AC檢測，按照試劑盒步驟要求，將存在MUC5AC抗體的微孔板中加入100 μL待測液，將其置于37℃環(huán)境中孵育2 h，經(jīng)過洗滌后，按照試劑盒步驟要求，進(jìn)行一抗及二抗孵育。待其顯色后，測定450 nm處的吸光度值，計(jì)算出MUC5AC分泌水平。研究p38參與MUC5AC分泌時(shí)，將細(xì)胞與不同濃度p38抑制劑SB203580預(yù)處理半小時(shí)（1、10及20 μmol/L），然后使用金黃色葡萄球菌腸毒素B作用24 h，采用ELISA法檢測MUC5AC分泌水平，步驟同上。

1.4 鼻黏膜上皮細(xì)胞中p38磷酸化檢測方式

收集濃度為100μg/L的金黃色葡萄球菌腸毒素B，分別處理0 min、15 min、30 min及60 min的細(xì)胞，采用蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液將細(xì)胞裂解，獲取的總蛋白采用Bradford法測量其濃度，在波長為595 nm的位置測量，隨后取20 μg蛋白制作聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使用5%脫脂牛奶，放置在封閉的室溫環(huán)境中2 h，進(jìn)行一抗及二抗孵育，并采用Image J軟件分析條帶灰度值，計(jì)算出磷酸化p38與及總p38灰度值的比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均納入到SPSS 22.0的Excel表中，進(jìn)行對比和檢驗(yàn)計(jì)算，計(jì)量資料行t值檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素B對人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC水平的影響

與經(jīng)金黃色葡萄球菌腸毒素處理的人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC水平比較，經(jīng)金黃色葡萄球菌腸毒素處理的人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC水平更高，且濃度越高，鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC水平越高，組間對比差異顯著（P＜0.05），見表1。

表1 金黃色葡萄球菌腸毒素B對人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC水平的影響

2.2 金黃色葡萄球菌腸毒素B對人鼻黏膜上皮細(xì)胞p38磷酸化的影響

100 μg/l的金黃色葡萄球菌腸毒素B刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞30 min后，即可測出p38磷酸化，且時(shí)間越久，濃度越高，60 min后到達(dá)峰值，細(xì)胞內(nèi)總p38水平無顯著變化，磷酸化p38及總p38比值，處理0 min、15 min、30 min及60 min后分別為（0.09±0.03）、（0.10±0.01）、（0.28±0.06）及（0.81±0.05），30 min及60 min與未經(jīng)金黃色葡萄球菌腸毒素B處理的人鼻黏膜上皮細(xì)胞比較差異顯著，且時(shí)間越長，比值越高（P＜0.05）。

2.3 SB203580對人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌MUC5AC水平的影響

人鼻黏膜上皮細(xì)胞采用1、10及20 μmol/L p38抑制劑SB203580預(yù)處理半小時(shí)后，分泌MUC5AC水平分別為（261.23±17.34）、（181.23±12.23）及（91.12±20.78）μg/L，顯著低于而未經(jīng)抑制劑SB203580預(yù)處理的細(xì)胞分泌MUC5AC水平（310.34±30.11）μg/L，且濃度越高，分泌量越少（P＜0.05）。

3 討 論

臨床研究證實(shí)，慢性鼻-鼻竇炎篩竇黏膜中MUC5AC的分泌水平較高，MUC5AC是氣道分泌物中主要的黏蛋白，其能濕化氣道，提高上皮細(xì)胞功能，是抵御外界刺激的屏障，但如果人體病原體感染，會(huì)使得黏蛋白的分泌量異常增多，使得黏液的防御能力及纖毛的清除能力得以下降，引發(fā)細(xì)菌感染，而常見的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌腸毒素B，其為疾病的主要治病菌，參與到疾病發(fā)生的全過程[2]。

感染金黃色葡萄球菌腸毒素B后，鼻黏膜上皮細(xì)胞會(huì)分泌過多的MUC5AC，從而加重病情，使得氣流受阻，黏液堆積在氣道中，使得起到的防御功能下降，從而加重感染，引發(fā)惡性循環(huán)[3]。本次研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度經(jīng)金黃色葡萄球菌腸毒素B處理后，MUC5AC分泌水平得以提升，且濃度越高，MUC5AC分泌水平越高，說明金黃色葡萄球菌腸毒素B影響MUC5AC分泌，受細(xì)菌感染，黏液分泌過多使得疾病加重。同時(shí)研究可知，100 μg/l的金黃色葡萄球菌腸毒素B刺激鼻黏膜上皮細(xì)胞30 min后，即可測出p38磷酸化，且時(shí)間越久，濃度越高，60 min后到達(dá)峰值，時(shí)間越長，比值越高，說明金黃色葡萄球菌腸毒素B能激活p38。同時(shí)，研究可知，隨著p38抑制劑SB203580濃度的提升，MUC5AC分泌水平得以降低，說明MUC5AC分泌與p38磷酸化有著直接關(guān)聯(lián)。

綜上所述，金黃色葡萄球菌腸毒素B通過p38促使人鼻黏膜上皮細(xì)胞分泌黏蛋白MUC5AC。