輪狀病毒感染BALB/c乳鼠乳糖不耐受模型的建立

章孝成，丁 銳，張曉燕，韓毛振，黃升海,

乳糖不耐受癥(lactose intolerance，LI)是由機體內乳糖酶缺乏所引起，癥狀為腹部不適、脹氣、和腹瀉等。LI是由于機體內乳糖酶缺乏而引起的腹部不適、脹氣和腹瀉等臨床癥狀。目前LI是影響兒童營養不良、發育遲緩的重要疾病，全球許多人群面臨不同程度的LI，嚴重影響人們的生活質量[1-2]。繼發性乳糖不耐受(secondary lactose intolerance, SLI)是一種暫時性LI，常繼發于腸道各種病毒或寄生蟲感染性疾病、克羅恩病或放射性腸炎等，使腸絨毛受損傷而出現乳糖酶的缺乏，發生LI腹瀉；待絨毛恢復能分泌足量乳糖酶后疾病有所恢復[3]。目前，SLI的發生機制研究并不完善，主要原因是缺乏相關的SLI動物模型。該文通過構建輪狀病毒(rotavirus,RV)感染7日齡BALB/c乳鼠SLI模型，為SLI的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株與病毒株恒河猴胚胎腎細胞MA104細胞株、輪狀病毒VR-2018病毒株均購自武漢病毒研究所，課題組自行培養保存。病毒復蘇后在MA104細胞上進行培養增殖，通過半數組織細胞感染劑量(median tissue culture infective dose，TCID50)測定感染劑量為10-4.51/0.1 ml后，用于灌胃感染乳鼠。

1.2 實驗動物SPF級1～8周齡BALB/c小鼠36只，由安徽省實驗動物中心提供，飼養于獨立送風隔離籠具系統內，該系統由安徽醫科大學基礎醫學院動物房提供，等級為P2級。待雌雄鼠自行配種生產乳鼠，隨機選取150只7日齡BALB/c乳鼠，3.5 ～4.0 g/只。

1.3 主要試劑DMEM培養基購自美國Gibco公司(批號：1868817)；小牛血清購自蕪湖天明生物技術有限公司(批號：C0257)；二甲基亞砜購自美國biosharp公司(批號：D5879)；乳糖酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所公司(批號：A082-1)；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司(批號：15596-026)；逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自北京全式金公司(批號：AH311-02、AE411-02)；其他各種規格的培養板購自美國Falcon公司。

1.4 RV增毒及感染劑量測定MA104細胞經0.2%EDTA、0.25%胰蛋白酶消化后反復吹打混勻，制成5×105/ml細胞懸液；將細胞懸液接種到24孔細胞培養板，1 ml/孔，在24孔細胞培養板中生長24 h后，細胞單層達90%融合，吸棄培養液，用無血清MEM培養液洗滌2次；每孔加入100 μl含7 μg/ml胰酶的無血清MEM培養液，再加100 μl病毒懸液混勻，37 ℃培養吸附1 h，每隔20 min取出搖勻一次；吸棄接種液，細胞用無血清MEM洗滌2次后加入1 ml含7 μg/ml胰酶的無血清DMEM培養，置于5%CO2、37 ℃培養箱中培養；逐日觀察細胞生長狀態，當80%以上細胞出現病變時收獲病毒。收獲的病毒懸液10倍連續稀釋，經TCID50測定，RV病毒懸液中感染性病毒為1×10-4.51/0.1 ml。

1.5 RV感染模型的建立將BALB/c乳鼠隨機分為3組：實驗感染組、PBS陰性對照組和正常對照組，每組5只，實驗感染組、PBS陰性對照組采用灌胃的方式接種，其中實驗感染組接種TCID50為1×10-4.51/0.1 ml RV病毒懸液，200 μl/只，PBS陰性對照組接種等體積PBS溶液，正常組對照組不接種任何試劑，乳鼠于接種前后各饑餓2 h，每天觀察乳鼠的腹瀉情況。

1.6 樣本的收集及檢測接種后每日處死乳鼠，無菌取乳鼠小腸組織，通過qPCR方法檢測病毒增殖水平，HE染色和乳糖酶活力檢測，觀察及檢測乳鼠小腸組織中RV的含量及其組織病理變化。

1.7 qRT-PCR法收取乳鼠小腸組織，預冷PBS洗滌3次后用TRIzol試劑提取總RNA，測定其純度和濃度后，按照EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒操作說明書配置逆轉錄反應體系和操作；靶cDNA按照TransStart Green qPCR SuperMix試劑盒操作說明書配置RT-PCR反應體系和操作。以GAPDH為本實驗的內參。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列及擴增片段長度

1.8 乳糖酶活力測定取新鮮的乳鼠腸組織勻漿，并測定其蛋白濃度，設立空白管、標準管、測定管和對照管4個實驗管，各管先加入50 μl底物，空白管加入25 μl雙蒸水，標準管加入25 μl濃度為5.55 mmol/L葡萄糖液，測定管加入25 μl乳鼠腸組織勻漿液，對照管不加任何物質，混均，37℃孵育20 min后各試驗管加入25 μl終止劑，對照管加入與測定管相對應的25 μl乳鼠腸組織勻漿液，各試驗管混均，4000 r/min離心10 min，取上清液備用，取96孔酶標板，加入8 μl上述的各試驗管的上清液，每個試驗管設立兩個復孔，每孔加入200 μl顯色劑，輕輕震蕩孔板，37℃孵育15 min后，酶標儀505 nm處讀取各孔吸光度(optical density, OD)值。通過公式：乳糖酶的活力(U/ mgprot )=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(5.55 mmol/L)/反應時間(20 min)/待測樣本蛋白濃度(mgprot/ml)×1 000

1.9 統計學處理使用SPSS22.0進行統計差異分析，實驗數據均數通過One way ANOVA即單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RV的增殖輪狀病毒VR-2018株感染正常MA104細胞后在細胞內增殖，病變細胞隨著病毒不斷復制和增殖而加重，細胞出現貼壁能力減弱、大量圓縮、懸浮、變形和破裂等現象，見圖1。

圖1 正常MA104細胞和RV感染的MA104細胞 ×400A：正常MA104細胞；B：RV感染的MA104細胞

2.2 qPCR檢測乳鼠小腸組織內RV相對含量小腸組織中RV NSP5基因通過熒光定量PCR檢測，結果顯示，RV感染第一天在小腸組織中即可檢測到，RV NSP5基因的mRNA表達含量呈現先升高后逐漸降低的趨勢，前4 d在小腸組織中病毒的表達水平均較高，其中第二天最高(P=0.0174，F=13.69)，感染第7天以后相對表達水平很低，見圖2。

圖2 實驗組乳鼠小腸組織RV NSP5基因mRNA表達

2.3 乳鼠攻毒后的腹瀉情況乳鼠攻毒后每隔24 h觀察其體征和腹瀉情況，連續觀察10 d并記錄。按壓乳鼠腹部產生應激排便，通過糞便的形態判斷腹瀉情況，腹瀉的評分參考標準分成3個等級：未腹瀉、普通腹瀉和嚴重腹瀉，通過觀察乳鼠糞便形態進行分級，未腹瀉：無便或正常固體糞便，記為0分或1分；普通腹瀉：黃色顆粒狀便，記為2分；嚴重腹瀉：軟便或水樣便，記為3分。通過觀察，正常對照組無腹瀉情況，實驗感染組感染后前3 d出現嚴重腹瀉，腹瀉持續約7 d左右。見圖3。

圖3 乳鼠腹瀉結果

2.4 乳鼠小腸外觀性狀解剖乳鼠觀察小腸組織外觀性狀：PBS陰性對照組和正常對照組小腸完整，表面光滑透亮；實驗感染組小腸色澤較正常對照組灰暗，小腸上皮有很多出血點，見圖4。

圖4 乳鼠小腸外觀性狀A：正常對照組；B：PBS陰性對照組；C：實驗感染組

2.5 乳鼠小腸組織切片HE染色取實驗感染組，正常對照組和PBS陰性對照組小腸組織進行HE染色。正常對照組和PBS陰性對照組整體狀態一致，小腸各層結構完整清晰，細胞胞質致密，絨毛排列整齊完整；實驗感染組乳鼠腸組織出現病變，表現為空泡，細胞水腫，有炎性細胞浸潤，小腸絨毛中分布的血管擴張充血，絨毛出現破損雜亂，絨毛長度較對照組變短。見圖5。

2.6 乳糖酶活力檢測與正常對照組比較，實驗感染組的乳糖酶活力在前4 d逐漸降低，第2天開始，差異有統計學意義(P=0.0173，F=11.26)，在第4天達到最低(P<0.01，F=15.88)，第5天后逐漸恢復到正常對照組水平。見圖6。

圖5 BALB/c乳鼠小腸組織 HE ×400

圖6 實驗組乳鼠小腸組織乳糖酶活力檢測

3 討論

RV是引起全球范圍內兒童腹瀉的主要病原體，主要經消化道傳播，是導致SLI的原因之一[4]。目前，關于RV導致腹瀉的動物模型相關報道很多，如牛、狗、豬、兔、羊和鼠等，其中由于鼠易獲得、易飼養、繁殖能力強等優點在很多的動物模型中被廣泛應用[5]。RV感染人體后在機體腸道的小腸上皮絨毛上端復制，使得腸上皮基底膜中粘連蛋白疏松，導致細胞間連接緊密性下降、小腸上皮微絨毛細胞骨架結構破壞，乳糖酶活性表達下降，進而引起腹瀉等一系列臨床癥狀。BALB/c乳鼠因動物體質量輕，易獲得，所用的病毒劑量小，實驗成本低，適合批量建模；BALB/c乳鼠能夠模擬嬰幼兒RV感染急性腸炎的臨床特征，可快速構建病毒感染動物實驗模型，實驗穩定性好，可重復。RV病毒感染方式為糞-口途徑傳播，故本實驗采用灌胃感染病毒，為排除人為操作等因素對小鼠機體損傷的干擾,設置PBS陰性對照組表明實驗的科學性與嚴謹性。RV感染后前3 d出現嚴重腹瀉，腹瀉約持續7 d左右，對照組陰性，表明病毒的感染能導致乳鼠腹瀉。HE染色結果顯示RV感染小腸組織后，小腸組織損傷、小腸絨毛結構破壞，出現水腫等炎癥反應，從病理學角度證明RV感染會導致小腸組織發生炎癥，進而引起位于腸上皮細胞刷狀緣上端的乳糖酶活性降低。通過乳鼠小腸組織乳糖酶活性檢測，表明RV感染后會影響到乳糖酶活性且使其降低。乳鼠乳糖酶活性的降低和出現腹瀉臨床癥狀表明乳鼠產生SLI。從病理結構來看，乳糖酶的活性和數量在空腸中最高，而RV主要侵襲小腸黏膜上皮細胞刷狀緣上端，使得腸上皮細胞發生空泡化，出現水腫和絨毛斷裂脫落的現象，致使小腸黏膜損傷，小腸組織結構破壞，嚴重影響到小腸黏膜吸收水分和電解質功能，從而引起腹瀉且使得乳糖酶的數量和活性降低[6-7]。本課題組的模型研究結果與之一致。