APE-1對肝癌細胞裸鼠成瘤能力及PKM2表達的影響及機制探索

孫志鵬，許光中，阿民布和，樊 慶，彭吉潤，張能維

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原發性肝癌中最常見的腫瘤，目前主要治療手段為手術治療，且放化療效果較差[1]。同大部分腫瘤一樣，HCC的早期診斷和手術的比例僅10%～20%，大多數患者在診斷時已是晚期或終末期[2]。肝癌的發生由多種因素共同作用，通過多種途徑引起，具體的發病機制尚不清楚。深入研究HCC的發病機制，尋找關鍵性的分子作為分子治療的靶點，對于肝癌的治療具有重要的意義。脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶-1(apurinic-apyrimidinic endonuclease 1，APE-1)是一種可以發揮DNA修復功能和氧化還原功能的蛋白，可調節腫瘤相關途徑的多種轉錄因子[3]。前期基于細胞水平研究[4]發現APE-1在肝癌組織和細胞中高表達，且其高表達與TNM分期、組織病理分級存在差異，沉默APE-1表達可降低肝癌細胞Hep 3B的增殖活性，提高細胞凋亡率。該研究基于動物模型水平，進一步探究APE-1對肝癌細胞裸鼠成瘤能力的影響及機制探索。

1 材料與方法

1.1 組織樣本及主要試劑

1.1.1實驗動物及細胞 20只4周齡SPF級BALB/c品系雄性健康裸鼠，體質量17～18 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。在首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院(北京大學第九臨床醫學院)SPF級實驗動物房飼養。所有飼料、水、空氣、鋪墊物及各種用品均需經過高溫高壓等滅菌處理。裸鼠處死取材后，用于免疫組化的樣品保存于組織固定液中，用于Western blot的組織立即轉入液氮保存。沉默APE-1表達的肝癌Hep 3B穩定細胞株及其對照由實驗室構建后保存[4]。

1.1.2主要試劑 SP-0023-SP免疫組化檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；APE-1(ab189474，免疫組化 1 ∶500；Western blot 1 ∶1 000)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)(ab92552，免疫組化 1 ∶500；Western blot 1 ∶2 000)、Ki-67(ab16667，免疫組化 1 ∶200；Western blot 1 ∶1 000)和PKM2(ab137852，免疫組化 1 ∶300；Western blot 1 ∶2 000)一抗抗體、GAPDH(ab181602，Western blot 1 ∶10 000)抗體購自英國abcam公司；蛋白提取RIPA裂解液、蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑購自江蘇碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與收集 復蘇沉默APE-1和對照組肝癌BEL-7402細胞，使用RPMI-1640完全培養基培養液(含10%FBS+1%雙抗)，在37 ℃，5%CO2細胞培養箱里培養，待細胞鋪滿培養瓶的瓶底時，用5%胰蛋白消化酶消化細胞，優質胎牛血清終止消化，輕輕吹打至細胞全部離壁，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。再用生理鹽水洗滌細胞2次。洗滌完成后生理鹽水重懸細胞，調整細胞濃度為1×107/ml，備皮下成瘤用。

1.2.2模型制備 SPF條件下20只BALB/c-Nude裸鼠適應性飼養2周，待到第三周時將裸鼠隨機均分為2組，分別編號。裸鼠右側腋窩皮下接種注射1×107/ml細胞懸液200 μl。接種細胞懸液8周后脫臼處死裸鼠，計算成瘤率。完整剝離腫瘤組織，稱瘤體質量并計算腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)=1/2(長徑×短徑×短徑)

1.2.3免疫組化檢測APE-1、PCNA、Ki-67和PKM2在2組成瘤組織中表達 組織經過切片、水化、抗原修復，分別滴加一抗和二抗，DAB顯色，中性樹膠封片。光學顯微鏡拍照，采用IPP軟件對圖片進行積分光吸光度(integrated option density，IOD)分析。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 收集2組成瘤組織，RIPA蛋白裂解液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳后NC膜恒流濕法進行轉膜。轉膜成功的NC膜轉移到5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉1 h。再將PVDF膜分別加入稀釋的APE-1、PCNA、Ki-67、PKM2和GADPH一抗，4 ℃輕搖過夜；隨后加入相應的二抗(1 ∶2 000)，37 ℃恒溫搖床孵育l h。蛋白的相對表達量用待測蛋白與GADPH的灰度值比值計算。

1.2.5基因表達相關性和生存曲線分析 基于TCGA數據庫中374例肝癌患者數據，通過可視化GEPIA軟件(http://starbase.sysu.edu.cn/panGeneCoExp.php)[5]分析APE-1和PKM2表達相關性及生存曲線分析。

2 結果

2.1 APE-1沉默抑制肝癌細胞裸鼠成瘤能力飼養至第8周，2組裸鼠成瘤率均為100%，且體質量呈現增長后趨于平穩趨勢，成瘤體積呈現持續增長趨勢，結果顯示APE-1沉默組的裸鼠體質量及成瘤體積均小于對照組(P<0.01)，見圖1。第8周末處死裸鼠，稱量瘤體重量并計算腫瘤體積，結果顯示APE-1沉默組和對照組瘤體重量分別為(0.203±0.028)、(1.00±0.105) g，腫瘤體積分別為(0.209±0.039)、(0.921±0.148) cm3；APE-1沉默組成瘤重量及體積均小于對照組(F=13.65、P<0.01，F=14.00、P<0.01)，見圖2。

圖1 成瘤過程中2組裸鼠體質量及成瘤體積與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.2 成瘤組織中APE-1、PCNA、Ki-67和PKM2表達檢測免疫組化和Western blot方法檢測2組成瘤組織中APE-1，細胞增殖標志性蛋白PCNA、Ki-67和PKM2的表達，結果顯示APE-1沉默組中蛋白表達均小于對照組(P<0.05)，見圖3、圖4。

圖2 2組裸鼠成瘤瘤體質量及體積比較

圖3 免疫組化檢測成瘤組織中APE-1、PCNA、Ki-67和PKM2表達 ×100

圖4 Western blot檢測成瘤組織中APE-1、PCNA、Ki-67和PKM2表達

2.3 APE-1和PKM2表達相關性分析基于TCGA數據庫中374例肝癌患者數據，分析表達相關性。結果表明，APE-1和PKM2在肝癌中表達正相關(R=0.33，P<0.001)，見圖5。

2.4 PKM2表達在肝癌患者中生存曲線差異結果顯示PKM2在肝癌患者中高表達組和低表達組整體生存曲線分布比較差異有統計學意義(P<0.001)，低表達組生存期更長，見圖6。

圖5 APE-1和PKM2表達相關性分析

圖6 PKM2表達在肝癌患者中生存曲線差異

3 討論

HCC是預后較差的腫瘤之一，其在分子水平上由多種遺傳、表觀遺傳和信號通路的失調，與腫瘤微環境相互作用導致腫瘤的發生、進展和轉移[6]。氧化還原因子APE-1已經被證實在多種腫瘤發生發展中發揮關鍵作用[7]。Choi et al[8]通過檢測277例膀胱癌(BCa)患者尿液中APE-1表達，發現BCa患者的APE-1水平顯著升高，并且與腫瘤分級和分期相關，暗示基于無創獲得的體液測量尿APE-1水平在臨床上可用于診斷BCa；這與Shin et al[9]研究成果血清APE-1可用作膀胱癌的潛在血清生物標志物一致。

在肝癌研究中，Di Maso et al[10]通過臨床樣本證實APE-1 mRNA含量隨著肝病的進展而增加，肝癌中APE-1轉錄水平的上調顯著增加。本課題組前期研究結果顯示APE-1在肝癌組織和細胞中均表達升高，其表達與TNM分期、組織病理分級存在差異。沉默APE-1表達可降低肝癌細胞Hep 3B細胞增殖活性，提高細胞凋亡率。APE-1在肝癌細胞中表現出了較強的抗腫瘤潛能[4]。與其它有關APE-1研究進展一致。

裸鼠腫瘤模型由于其保留原發腫瘤本身的形態特征及遺傳性，是研究人類腫瘤生物特性以及腫瘤治療的常用手段；且因為裸鼠腫瘤模型具有成瘤率高、均一性好，能夠準確反應腫瘤的生物學特性等優點，因此通過培養瘤細胞來建立裸鼠皮下移植瘤模型，可以為腫瘤治療的相關研究提供可靠的動物模型。基于前期細胞水平研究，通過建立裸鼠成瘤模型探索APE-1對肝癌發生的影響。結果顯示在動物體內成瘤過程中，APE-1沉默組的裸鼠體質量及成瘤重量/體積均小于對照組，表明APE-1沉默抑制肝癌細胞成瘤能力。增殖細胞核抗原PCNA與細胞DNA合成關系密切，在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態的良好指標[11]；Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，在細胞增殖中不可缺少，其表達越高，說明細胞增殖越活躍，腫瘤生長越快，組織分化越差，對化療也越敏感[12]。通過免疫組化檢測成瘤組織，顯示APE-1沉默組中細胞增殖標志性蛋白PCNA、Ki-67表達均小于對照組，暗示成瘤抑制作用是由沉默APE-1降低肝癌細胞Hep 3B細胞增殖活性所導致的，與前期研究基礎一致[4]。

此外還顯示APE-1沉默組腫瘤組織中PKM2蛋白表達低于對照組。丙酮酸激酶M2，也稱為PKM，是糖酵解過程最后一步的限速酶。PKM2以無活性單體、低活性二聚體和活性四聚體形式存在，通過高活性四聚體及低活性二聚體之間的轉換，調節腫瘤細胞能量和底物供給之間的平衡，對于腫瘤發生至關重要[13]。Dayton et al[14]通過構建PKM2缺失小鼠，發現PKM2的喪失導致具有高滲透性的HCC的自發發展，并伴隨著以系統性葡萄糖穩態，炎癥和肝脂肪變性改變為特征的全身代謝的逐步變化。基于癌癥和TCGA腫瘤標本數據庫中374例肝癌患者數據，證明APE-1和PKM2表達線性正相關，且PKM2在肝癌患者中高表達組和低表達組整體生存曲線分布比較差異有統計學意義，低表達組生存期更長。暗示PKM2作為抑癌基因，APE-1可能通過影響PKM2抑制肝癌細胞裸鼠成瘤能力。

綜上所述，APE-1在體內同樣具有較強的抗腫瘤潛能，其可能通過影響PKM2抑制肝癌細胞裸鼠成瘤能力。