高氧干擾海馬區(qū)星形膠質細胞的生長發(fā)育

趙鈺瑋，劉光輝，劉永清，王丹丹，張 健

星形膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)細胞，保證正常的血腦屏障，為神經(jīng)元提供足夠的

2020-07-14接收

基金項目：安徽省自然基金青年項目(編號：1508085SQH219)

作者單位：1安徽省兒童醫(yī)院新生兒科，合肥 2300512安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院高新分院新生兒科 合肥 230022

作者簡介：趙鈺瑋，女，博士，副主任醫(yī)師，責任作者：zyw3257@sina.com

營養(yǎng)支持，維持腦內(nèi)神經(jīng)遞質和細胞外離子環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后可能影響神經(jīng)元的生長發(fā)育[1]。氧療是新生兒急救的重要治療手段，但高濃度氧可能引起腦損傷，加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]。 該文通過對日齡6 d新生鼠暴露80%高濃度氧24 h，建立大鼠高氧模型，探討高氧對未成熟腦內(nèi)海馬不同區(qū)域中星形膠質細胞生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 模型制備與實驗分組將新生6 d清潔級健康大鼠隨機分為高氧組和對照組，每組5～6只。高氧組與哺乳母鼠共置于高氧箱中24 h，采用數(shù)字測氧儀(ProOX110，美國BioSpheri公司)持續(xù)檢測箱內(nèi)氧氣濃度，維持箱內(nèi)氧氣濃度始終80%，對照組與哺乳母鼠置于同室空氣中飼養(yǎng)。分別在新生鼠日齡7、14、21 d取材。

1.2 標本的采集和處理將日齡7、14、21 d 新生鼠用10%水合氯醛2.0 ml/只麻醉后，固定于自制的手術木板上，開胸暴露并游離出心臟，經(jīng)左心室插入灌流針并固定，剪開大鼠右心耳，在大鼠左心室緩慢灌注4 ℃磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，直到肝和肺臟顏色轉白及右心房流出液澄清，再灌注4 ℃ 4%多聚甲醛15 ml，直至大鼠僵直狀態(tài)，斷頭取腦，將新鮮腦組織置于4%多聚甲醛浸泡固定24 h后行冰凍切片后行免疫熒光實驗。

1.3 免疫熒光技術及圖像采集取新鮮腦組織于4%PFA固定1 d后行冰凍切片，PBS離心洗滌2次，10%正常血清封閉10 min，然后滴加GFAP抗體(1 ∶200，Abcam,英國)，4 ℃孵育2 h。洗滌后，滴加熒光素標記抗體，37 ℃保溫30 min。將和增殖抗體和凋亡抗體免疫熒光共染色的切片，再次PBS離心洗滌，10%正常血清封閉10 min后滴加ki67抗體(1 ∶100，Affinity bioscience)或capase 3抗體(1 ∶100，Affinity bioscience)，4 ℃孵育2 h。洗滌后，滴加熒光素標記抗體，37 ℃保溫30 min。

所有切片洗滌后，封片，免疫熒光顯微鏡(Eclipse 80i，日本尼康公司)下觀察海馬CA1、齒狀回(dendategyrus, DG)和hilus區(qū)域，選取200倍鏡像拍照后采用捷達801D形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)軟件進行熒光強度測定。

2 結果

2.1 高氧后新生大鼠海馬內(nèi)星形膠質細胞的生長情況在海馬CA1和DG區(qū)域高濃度氧刺激后星形膠質細胞在日齡7、14和21 d時均無明顯變換。但海馬hilus區(qū)域對照組新生大鼠海馬內(nèi)星形膠質細胞的熒光強度隨日齡增加而逐漸增加，高濃度氧刺激后星形膠質細胞在日齡7和14 d時無明顯變化，日齡21 d時星形膠質細胞熒光強度較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.041)(圖1)。

2.2 高氧后新生大鼠海馬內(nèi)星形膠質細胞的增殖情況高氧組海馬DG、hilus和CA1區(qū)域增殖細胞與星形膠質細胞的熒光強度比值在日齡7 d時較對照組均降低，hilus和CA1區(qū)域其熒光比值與對照組比，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.036、P=0.040)。高濃度氧刺激后海馬DG、hilus和CA1區(qū)域其比值在日齡14、21 d時與對照組比較無明顯統(tǒng)計學變化(圖2)。

2.3 高氧后新生大鼠海馬內(nèi)星形膠質細胞的凋亡情況高氧組海馬DG、hilus和CA1區(qū)域凋亡細胞與星形膠質細胞的熒光強度比值在日齡7 d時均較對照組降低，但差異均無統(tǒng)計學意義。高氧組海馬DG、hilus和CA1區(qū)域其比值在14 d和21 d時的變化與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(圖3)。

圖1 不同日齡新生大鼠海馬DG、Hilus和CA1區(qū)星形膠質細胞的變化

3 討論

該研究通過建立高氧大鼠動物模型，顯示24 h 80%高氧引起未成熟腦早期海馬hilus和CA1區(qū)域星形膠質細胞的增殖障礙，同時還引起未成熟腦早期海馬hilus區(qū)域星形膠質細胞的遲發(fā)性生長障礙。提示短時間的高濃度氧可能對未成熟腦產(chǎn)生一定損傷。但24 h 80%高氧引起未成熟腦海馬區(qū)域的星形膠質細胞凋亡，可能與高濃度氧損傷時間過短以及海馬區(qū)域相對于腦內(nèi)其他區(qū)域可能具有一定的抗凋亡能力有關。

圖2 不同日齡新生大鼠海馬DG、Hilus和CA1區(qū)星形膠質細胞的增殖情況

氧氣療法通過給予高濃度氧氣吸入氧提高肺泡內(nèi)的氧分壓，改善血氧飽和度，維持良好的呼吸功能，能夠及時糾正低氧血癥和高碳酸血癥，因此，氧療已經(jīng)成為治療早產(chǎn)兒窒息缺氧的重要措施之一。目前已經(jīng)證實高濃度氧會引起視網(wǎng)膜病變[3]和慢性肺部疾病[4]，同時國內(nèi)外研究[5-6]提示高濃度氧可能會加重新生兒腦損傷，從而增加神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生率。課題組前期實驗已證實24 h 80%高氧引起未成熟腦內(nèi)海馬區(qū)域神經(jīng)元細胞和少突膠質細胞神經(jīng)的早期生長增殖障礙，而本研究也顯示24 h 80%高氧引起未成熟腦海馬區(qū)域的星形膠質細胞的早期生長增殖障礙，因此進一步證實即使24 h短時間高濃度氧同樣可能引起早期神經(jīng)細胞的發(fā)育異常。星形膠質細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的神經(jīng)細胞，保證正常的血腦屏障，提供神經(jīng)元足夠的營養(yǎng)支持，維持腦內(nèi)神經(jīng)遞質和細胞外離子環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在感染、缺氧窒息等病理狀態(tài)下，活性星形膠質細胞是膠質增生的主要參與者，并且和脫髓鞘病變及軸損傷有密切聯(lián)系[7]。有研究[5]表明48 h 80%高濃度氧抑制星形膠質細胞的活性，減少其增殖并加重細胞凋亡。本研究中顯示24 h 80%高濃度氧引起未成熟腦海馬區(qū)域的星形膠質細胞的早期增殖障礙，但僅在hilus區(qū)域和DG區(qū)域的星形膠質細胞的增殖異常差異有統(tǒng)計學意義，可能和海馬區(qū)域的選擇性損傷特點有關[8]。在缺氧缺血性腦損傷中相比較海馬其他區(qū)域，hilus區(qū)域中的hilar神經(jīng)元以及CA1區(qū)域中的椎體神經(jīng)元極易損傷[8]，本研究中高濃度氧的海馬區(qū)域損傷也發(fā)生在這兩個區(qū)域。除此以外，高氧引起未成熟腦早期海馬hilus區(qū)域星形膠質細胞的遲發(fā)性生長障礙，提示即使短時間高濃度氧仍可能引起遠期神經(jīng)細胞損傷。

圖3 不同日齡新生大鼠海馬DG、Hilus和CA1區(qū)凋亡情況

有研究[9]顯示高氧通過不同的凋亡路徑引起未成熟腦內(nèi)廣泛細胞凋亡，但本研究中顯示24 h 80%高氧刺激后海馬DG、hilus和CA1區(qū)域凋亡細胞與星形膠質細胞的熒光強度在早期及成熟期日齡中均較對照組無統(tǒng)計學上的變化，提示24 h 80%高氧并未引起未成熟腦海馬區(qū)域的星形膠質細胞的凋亡。有學者[10]早在1998年就發(fā)現(xiàn)了相似的結果，在暴露大鼠在95%高氧中5 d后發(fā)現(xiàn)在腦內(nèi)基底節(jié)和紋狀體區(qū)域出現(xiàn)細胞凋亡增多，但海馬區(qū)域無明顯細胞凋亡。這些提示未成熟腦內(nèi)不同區(qū)域神經(jīng)細胞的抗凋亡能力不同，可能海馬區(qū)域相比較腦內(nèi)其他區(qū)域具有更強的抗凋亡能力。