谷氨酰胺轉運蛋白ASCT2介導激活突變Ptpn11(SHP2)促進骨髓增殖性腫瘤的發生

馬牧天，譚振亞，周園琴，吳夢月，鄭 紅

骨髓增殖性腫瘤 (myeloproliferative neoplasma，MPN)是一類以一種或幾種骨髓細胞持續異常增殖為特征的疾病，被認為是髓系腫瘤的一種[1]。在病理后期可轉化為急性白血病。蛋白質酪氨酸磷酸酶2(domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2, SHP2)是一種由Ptpn11基因編碼的非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶，在造血細胞的生長發育、增殖分化過程中起著十分重要的作用。多種類型的白血病患者體內存在SHP2蛋白的異常活化，因此，SHP2被認為是白血病的原癌基因[2-4]。谷氨酰胺轉運蛋白2(alanine-serine-cysteine transporter 2, ASCT2)是由Slc1a5基因編碼的中性氨基酸載體，在多種癌癥中可通過調節腫瘤細胞對谷氨酰胺的攝入來影響腫瘤的發病，抑制ASCT2的表達則可有效的抑制癌細胞的惡性增殖[5-7]，但血液系統疾病與ASCT2相關的研究報道很少，與MPN發病機制的關系研究尚不清楚。該研究通過構建SHP2激活突變鼠，觀察ASCT2對SHP2激活突變后致骨髓增殖性腫瘤的調控作用，為臨床治療尋找新的靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 自實驗小鼠體內分離的原代細胞，包括小鼠骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，MSC)：MSC(Ptpn11+/+)和MSC(Ptpn11E76K/+)；造血干細胞(hematopoietic stem cells, HSC): HSC(Ptpn11+/+)和HSC(Ptpn11E76K/+)。

1.1.2主要試劑 Western blot實驗抗體購自美國Cell Signaling公司；Glutamate Assay Kit購自美國Cell BIOLABS公司；DMEM、胰蛋白酶(Trypsim)購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合溶液(雙抗)購自美國Hyclone公司；PBS粉末、牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma公司；其他試劑和耗材均購自上海生物工程(生工)股份有限公司。

1.1.3主要儀器 細胞培養箱(型號ELCETRON CORPORATION)、酶標儀(型號3001)、高速低溫離心機(型號MultifugeX1R)購自美國賽默飛世爾科技公司；恒溫磁力攪拌器(型號79HW-1)、渦旋振蕩器(型號XH-89)購自樂清樂成電器廠；倒置顯微鏡(型號ECLIPSE TS100)購自日本尼康公司；凝膠成像儀(型號FC3)購自美國普諾森公司；超聲波細胞破碎儀(型號JY92-2D)購自寧波新芝科技公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物的構建 Ptpn11E76K/+突變鼠來自美國埃默里大學血液/腫瘤系瞿成奎教授惠贈；Mx1-Cre+小鼠(C57BL/6J品系)購自上海南方模式動物中心，于安徽醫科大學基礎醫學院動物實驗中心SPF級環境中飼養擴繁，于鼠齡4～5周鑒定后，對突變鼠(Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+)注射PIPC誘導。

1.2.2骨髓細胞的提取 全程無菌操作，脊柱脫臼處死小鼠后，用75%乙醇浸泡小鼠消毒3 min，自腹部將小鼠皮膚剪開并撥下下肢皮膚，選小鼠后肢自髖關節剪下，存放于無菌PBS中，將小鼠后肢轉移至細胞間。將小鼠后肢自膝關節分開，并將骨頭上的軟組織與骨頭分離干凈，留下干凈的腿骨，置于另一無菌培養皿中，并用PBS浸泡清洗。用5 ml注射器從小鼠腿骨兩端鉆孔，直至有落空感且針頭進入骨內，使骨髓腔兩端都與外界相連。吸取1～2 ml無菌PBS反復從腿骨兩端沖洗骨髓腔，直至腿骨整體呈白色為止。將含有骨髓細胞的PBS轉移至EP管中，吹打均勻后，800 r/min轉速離心3 min，吸棄上清液，沉淀即為全骨髓細胞，可用完全培養基重懸細胞至培養皿中進行接種培養。

1.2.3細胞分選與培養 HSC采用流式分選獲得；MSC利用磁珠分選獲得；MSC培養于含10%FBS的DMEM、含1%雙抗青鏈霉素混合溶液中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中。

1.2.4MTT實驗法 消化培養皿中的細胞，并用完全培養基溶液(含10%FBS)配制成單個細胞懸液，計算細胞數。以每孔體積180 μl、細胞數量800～1 200個，將細胞接種至96孔板，置于37 ℃，5%CO2的飽和濕度培養箱中培養1～2 d。每孔加入20 μl MTT溶液(PBS溶液配制，5 mg/ml，pH7.4)，繼續孵育4 h后，離心后棄去上清液。每孔加入150 μl DMSO，置于37 ℃環境下，震蕩10～20 min，使結晶充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上使用490 nm波長，測定各孔吸光度(optical density, OD)，并記錄結果。

1.2.5谷氨酸檢測 將超純水和10×分析緩沖液按照9:1的比例稀釋成1×分析緩沖液。按照說明書制備反應混合物溶液，用1×分析緩沖液調整熒光探針最終濃度為100 μmol/L、HRP最終濃度為0.2 U/ml、谷氨酸氧化酶為0.08 U/ml、谷氨酸丙酮酸轉氨酶為0.5 U/ml、L-丙氨酸為200 μmol/L(反應混合物溶液可在4 ℃環境中儲存1 d)。用PBS將細胞濃度調整為1×106～2×106個 /ml，轉移細胞懸液至1.5 ml EP管中，冰上放置。使用超聲波細胞破碎儀破碎EP管中的細胞(間隔8 s，工作3 s，總時長6 min)。將L-Glutamate標準品溶液以1 ∶10的比例，用試劑盒中的1×分析緩沖液稀釋配制谷氨酸鹽標準品，配制成的每孔50 μl體積的梯度濃度標準品(谷氨酸濃度分別為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0 μmol/L)加到96孔板中。每孔中加入50 μl反應混合物溶液，充分混合后，用錫箔紙完全包裹96孔板，置于37 ℃無光照環境下孵育30～45 min。在酶聯免疫檢測儀上使用590～600 nm的波長，測定各孔OD值，并記錄結果。

2 結果

2.1 Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠模型的構建構建模型的原理是利用了生物基因的同源修復機制，基因修飾使得一條鏈上76位點E突變為K后的Ptpn11部分外顯子序列插入小鼠DNA中，此DNA序列同時包含有一個Neo盒并連著一個STOP位點，并且在Neo盒和STOP位點的兩端各有一個LoxP位點。此時在無Cre酶的誘導下，由于此序列中存在STOP位點，此E76K位點無法完整轉錄翻譯，該條基因鏈上的突變SHP2基因無法表達。 通過注射PIPC增加干擾素(IFN)的產生誘導Mx1 啟動子啟動Cre重組酶的表達，作用于插入DNA序列中LoxP位點，定向切除Neo盒和STOP位點，使得E76K突變的Ptpn11可以完全成功轉錄翻譯而誘導Ptpn11激活突變表達，見圖1A，特異性地在轉基因小鼠的造血系統及間充質干細胞中實現了Ptpn11E76K基因的表達，此時突變小鼠體內SHP2蛋白得以正常表達，見圖1B，插入DNA序列中的Neo盒在骨髓細胞和間充質干細胞中約96.1%和95.4%被切除(F=47.841、56.250，P<0.001)，見圖1C。

2.2 Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠發生MPN，HSC體外增殖能力增強且依賴培養環境中的谷氨酰胺突變小鼠PIPC注射結束約40 d后，可出現脾臟腫大至0.42 g(正常0.08 g)(F=34.452，P<0.01),見圖2A。骨髓及脾臟中髓系細胞增多(F=62.228、43.123，P<0.01)，見圖2B，顯示已罹患MPN。將Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+突變小鼠和Ptpn11+/+Mx1-Cre+正常小鼠體內的HSC和MSC自骨髓中分離純化，并進行體外培養。利用MTT法檢測HSCs在體外的增殖能力可觀察到，突變小鼠體內的HSCs增殖能力強于正常小鼠，見圖2C，但將培養基去除谷氨酰胺后，突變小鼠的HSCs增殖能力反而會弱于正常小鼠，見圖2D，提示Ptpn11E76K/+Mx1- Cre+激活突變鼠HSC的體外高增殖能力依賴于外界環境中谷氨酰胺的含量。

2.3 Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠體內谷氨酰胺的含量和ASCT2的表達量Western blot技術檢測激活突變鼠體內ASCT2的變化，突變小鼠骨髓細胞中ASCT2的表達高于正常小鼠，并且檢測Ptpn11+/+Mx1-Cre+正常小鼠和Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠血清及細胞內的谷氨酰胺含量,顯示突變小鼠血漿、骨髓細胞中谷氨酰胺含量高于正常小鼠(F=36.454、65.243，P均<0.01)。同時在構成骨髓微環境的MSC中，激活突變鼠的谷氨酸是正常小鼠的3倍左右(F=62.224，P<0.01)，由于谷氨酰胺是谷氨酸的轉化前體和主要來源，在其轉化過程中谷氨酰胺被水解為谷氨酸和氨，顯示SHP2突變型白血病細胞為維持自我增殖的能量、氮源等需求，對谷氨酰胺的攝取能力增強。見圖3。

圖1 成功構建Ptpn11E76K/+ Mx1-Cre+激活突變鼠

圖2 Ptpn11E76K/+ Mx1-Cre+激活突變鼠細胞體外增殖能力高度依賴谷氨酰胺的濃度

圖3 Ptpn11E76K/+ Mx1-Cre+激活突變鼠的谷氨酰胺水平增高

2.4 Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠的細胞能量代謝增強，能量應激及增殖相關的常見信號分子表達增強之前的實驗證明，Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠腫瘤模型ASCT2的表達增高，而且大量攝入谷氨酰胺。檢測兩組小鼠HSC內代謝情況，顯示突變小鼠細胞上清液中乳酸水平是正常小鼠的2倍左右(F=73.46，P<0.001)，ATP產生是正常小鼠3倍到5倍左右(F=36.25、54.237，P<0.001 )，反映其糖酵解能力增強，見圖4A、B。同時利用Western blot技術檢測突變小鼠體內相關蛋白的表達水平，表明突變小鼠骨髓細胞內p-mTOR、p-AKT、p-ERK表達增強，p-mTOR/p-S6信號通路也增強，見圖4C。

2.5 抑制ASCT2對谷氨酰胺的攝取，可遏制Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠GPNA是較為常見的ASCT2拮抗抑制劑，它可以通過與ASCT2競爭性結合抑制細胞對谷氨酰胺的攝取。將Ptpn11E76K/+Mx1-Cre+激活突變鼠隨機分成兩組，分別為實驗組和抑制處理組：在對兩組小鼠注射PIPC誘導完成后，抑制處理組立即注射GPNA溶液，實驗組不做處理，持續4周，觀察兩組小鼠的情況。注射GPNA的處理組小鼠其脾臟小于未注射的小鼠(F=34.230，P<0.01)，而且其細胞內谷氨酸含量少于實驗組(F=23.440， P<0.01)。見圖5A、B。利用Western blot技術檢測2組小鼠體內相關蛋白的表達水平，表明抑制ASCT2后，其體內p-mTOR表達降低，顯示p-mTOR信號通路活性被抑制，見圖5C。HE染色顯示注射GPNA溶液的處理組小鼠骨髓、脾臟、肺部和肝中炎性細胞浸潤減輕，顯示其MPN的發病進程被抑制。

圖4 Ptpn11E76K/+ Mx1-Cre+激活突變鼠細胞的能量代謝增強，細胞增殖相關信號表達增強

3 討論

細胞代謝重構是各種腫瘤細胞普遍的特征[8-9]，細胞分化和生長之間的平衡通常與新陳代謝有關，HSCs 的代謝調控日益受到關注。正常 HSC 必須定居在骨髓中低氧、低營養物質的環境中通過激活糖酵解來保持靜息狀態[10-12]。在增殖和自我更新的過程中，需要葡萄糖、脂肪酸以及氨基酸三大營養物質的代謝提供 ATP 供能。而腫瘤細胞主要依賴葡萄糖和谷氨酰胺。當葡萄糖的代謝途徑主要依靠糖酵解產生 ATP 時，谷氨酰胺就成為增殖期細胞(包括腫瘤細胞)的關鍵的能量來源,它通過代謝可以轉化為α-酮戊二酸，進入 Krebs 循環不僅為細胞提供 ATP，還為大分子合成提供前體物質。但谷氨酰胺必須通過載體的轉運才能進入細胞內，其中載體 ASCT2 起重要作用。ASCT2(Slc1a5 基因編碼)是一個廣譜的中性氨基酸載體，主要轉運谷氨酰胺、丙氨酸、絲氨酸和半胱氨酸等，為細胞代謝提供重要的營養底物[13-14]。雖然對谷氨酰胺載體 ASCT2 的生理學功能進行了大量的研究，病理情況下，尤其是在血液系統腫瘤中的調控作用相關研究并不多。關于 ASCT2 對 SHP2 激活突變后骨髓微環境及造血干細胞代謝的影響及功能調控，目前尚無報道。本課題探討了 SHP2 激活突變后ASCT2 對代謝的影響進而揭示其影響疾病發生發展的相關機制。

在低糖和谷氨酰胺缺乏的情況下，干細胞會因為ATP 的缺乏很快死亡[15]。本研究顯示SHP2 激活突變后造血干細胞的體外增殖能力增強，去除了培養基中的谷氨酰胺后，增殖能力降低，死亡增多，表明突變細胞的增殖能力增強是谷氨酰胺依賴性的。同時突變鼠的骨髓細胞及間充質干細胞中檢測到了高濃度的谷氨酰胺水平。進一步檢測突變鼠的骨髓細胞及間充質干細胞中谷氨酰胺轉運蛋白 ASCT2 的表達情況，ASCT2 的蛋白表達異常增高。

進一步檢測突變鼠的代謝情況顯示ATP產生量增加，乳酸水平增高，同時與細胞能量應激、增殖相關的p-mTOR/ p-S6、p-AKT、p-ERK信號分子表達增強。為了證實ASCT2對骨髓造血干細胞及其微環境代謝的影響及SHP2激活突變所致白血病的靶向調節作用，課題組給突變小鼠腹腔注射ASCT2的抑制劑(GPNA)，顯示相較于未處理的突變組，抑制組小鼠的脾臟較小，骨髓、脾臟、肺及肝臟等臟器中炎性細胞浸潤減輕，發生 MPN 及白血病的幾率很少，死亡率降低。同時與能量應激相關的p-mTOR信號分子也弱于未處理的突變組，證實了谷氨酰胺轉運蛋白ASCT2在SHP2激活突變致骨髓增殖性腫瘤中的調控作用，提示ASCT2蛋白可能是一個新的治療靶點。

圖5 抑制小鼠ASCT2蛋白功能，可抑制MPN(和/或白血病)發病進程 ×20