miR-26b調控Wnt/β-catenin信號通路促進成肝樣分化MSCs遷移研究

吉楊丹，羅紅陽，王 丹，王 恒，楊小燕，何志旭，劉金河，汪顯耀，趙 錦，張麗娟，張玲敏，秦 臻，許鍵煒，

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)因具有自我復制和多向分化潛能，可用于多種損傷性疾病的組織重建與修復[1]。臨床和動物實驗研究發現，MSCs能靶向受損的肝組織，對急慢性肝損傷均有修復作用，但療效并不穩定，個體差異非常大。究其原因，可能與MSCs的遷移歸巢和分化以及局部微環境的影響有著密切的關系[2]。研究[3]發現，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)能趨化MSCs向病灶部位遷移。同時微小RNA (microRNA，miRNA)參與了細胞的遷移、增殖、分化[4]，在生命活動中起重要作用。課題組前期研究[5]發現miR-26b和Wnt/β-catenin信號通路參與了 MSCs干性的維持以及趨化遷移的調控。該實驗以miR-26b作為研究靶點，初步探討其對Wnt/β-catenin信號通路以及成肝樣不同分化狀態MSCs向HGF趨化遷移的影響，為MSCs作為種子細胞定向遷移治療肝損傷及相關機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料SD大鼠[貴州醫科大學實驗動物中心，動物合格號SYXK(黔)2018-0001]，L-DMEM培養基、l0%FBS及0.25%EDTA(美國Hyclone公司)，HGF、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(美國Sigma公司)，相差顯微鏡(德國Leica公司)，CO2培養箱(美國Thermo Forma公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，超凈工作臺(蘇州蘇凈集團)，細胞培養箱(Model311)、SYBR Green RT-qPCR 試劑盒(美國Thermofisher公司)，臺式高速冷凍離心機(Allegra 64R，美國貝克曼庫爾特公司)，qRT-PCR儀(StepOne，美國ABI公司)，U-LH100L-3活細胞工作站(日本OLYMPUS公司)，TRIzol、轉染試劑(美國Ambion公司)，miR-26b引物(廣州銳博生物科技公司)，Q-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1大鼠MSCs的培養、鑒定 取5～8周齡、體質量(150±20) g SD大鼠，乙醚麻醉處死后取兩側股骨，剪去股骨兩端，用注射器吸取L-DMEM混合液從骨髓腔反復沖出骨髓至無菌平皿中。接種于25 cm2的培養瓶中，加入含有10%FBS的L-DMEM液，5%CO2、37 ℃恒溫培養，3～4 d換液1次。細胞生長鋪展至瓶底約80%～90%后0.25%EDTA消化傳代。培養至第4代，采用流式細胞術分析細胞膜表面分子CD71、CD29、CD45和CD34的表達。

1.2.2miR-26b對Wnt/β-catenin信號通路的影響 選用生長至80%左右匯合的第四代MSCs，通過感染重組腺病毒(Ad-26b)高表達miR-26b，亂序的空病毒(Ad)為對照(由課題組前期包裝重組腺病毒獲得)[5]，PBS洗2次，按濃度為107pfu/ml的病毒液，每個培養皿中加入100 μl，37 ℃孵育1.5～2 h后更換為完全培養基培養48 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達。選取表達強且感染效率高的MSCs，PBS清洗2次，加入液氮，以200 μl細胞裂解液提取總蛋白，并按說明書進行操作。Western blot檢測activated β-catenin(ABC)、β-catenin、p-β-catenin(S33/S37/T41)蛋白表達的變化。將上述細胞用PBS液清洗3次。TRIzol RNA，參照試劑盒說明書，去除基因組DNA，將總RNA逆轉錄成cDNA，以GAPDH作為內參，qRT-PCR檢測Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因c-Myc，RUNX2轉錄水平的變化。

1.2.3miR-26b對MSCs黏著斑(focal adhension,FA)、細胞骨架及形態的影響 選取上述表達強且感染效率高的MSCs，消化重懸，將細胞稀釋成1×104/ml的細胞懸液，接種至多聚賴氨酸(polylysine，PLL)包被的玻片上，樁蛋白(Paxillin)免疫熒光染色觀察FA，細胞鋪展面積和極性指數(長軸和短軸之比)。

1.2.4成肝樣不同分化狀態MSCs的制備及miR-26b在不同狀態MSCs中的表達 根據MSCs成肝樣細胞分化狀態，將分化過程分為A、B、C、D 4個時間點。未分化的細胞狀態設為A點，加入HGF、EGF、bFGF(加入量均為10 μl/L)與MSCs建立誘導共培養體系，加入誘導劑第7天(設為B點)，第14天(設為C點)，第21天(設為D點)分別得到4種處于不同分化狀態(A、B、C、D) 的細胞用于后續實驗。qRT-PCR檢測不同狀態MSCs中miR-26b的相對表達量。見表1。

表1 各基因RT-qPCR引物一覽表

1.2.5miR-26b對不同分化狀態的MSCs趨化遷移的影響 選用生長匯合至80%左右的第4代MSCs，通過感染重組腺病毒(Ad-26b)高表達miR-26b，空病毒(Ad)為對照(方法同1.2.2)。選取表達強且感染效率高的細胞用于誘導成肝樣細胞遷移實驗。誘導分化方法同1.2.4。

1.2.5.1Transwell趨化遷移實驗 取不同分化狀態各組細胞，制備成2×105/ml的細胞懸液，將8.0 μm孔徑的Transwell小室置于24孔培養板，在上室加入細胞懸液200 μl/孔，同時在下室加入500 μl含HGF(25 ng/ml)L-DMEM，于37 ℃、5%CO2濃度的培養箱孵育6 h，對下室細胞采用4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫浸泡染色30 min，PBS漂洗3次后顯微鏡下拍照，計算遷移至室膜下方的細胞總數。將對照組的遷移細胞數作為基數，標準化定義為1。

1.2.5.2Dunn chamber遷移實驗 將上述不同分化狀態的細胞按1×104/ml的濃度接種在含PLL包被蓋玻片的培養皿中，在Dunn chamber內槽加滿分化培養基，取長有細胞的蓋玻片細胞面朝下，放置在槽的正上方，一側僅蓋住橋不蓋住外槽，另外3側用凡士林封片，外槽加入含HGF(25 ng/ml)的L-DMEM液，凡士林封口。外槽內的趨化因子在張力的作用下緩慢滲入內槽，在內外槽之間形成濃度梯度。Dunn chamber置于活細胞工作站顯微實時攝影系統，每5 min拍照1次，連續拍攝6 h。隨機選擇30個未與其他細胞產生牽拉的細胞，Cellsens軟件分析細胞遷移的軌跡，統計遷移距離，計算遷移速率(μm/min)。

2 結果

2.1 大鼠骨髓可分離、培養、擴增MSCs顯微鏡下可見原代培養的細胞在4～6 h開始貼壁，5 d后呈集落生長并迅速增多，傳至第3代后，大部分細胞呈長梭形，流水、漩渦狀生長。見圖1。課題組前期用同樣方法培養的細胞，流式細胞術檢測結果顯示大鼠MSCs: CD71、CD29呈陽性表達，而CD45和CD34呈陰性。

圖1 第4代骨髓間充質干細胞 ×100

2.2 miR-26b參與對Wnt/β-catenin信號通路的調控取上述重組腺病毒感染48 h后高表達miR-26b的MSCs，在綠色熒光顯微鏡下可觀察到約70%左右的MSCs發綠色熒光。qRT-PCR檢測Ad-26b組miR-26b的表達量較空病毒對照組上調，可用于后續實驗。感染48 h后提取總RNA，qRT-PCR檢測MSCs中miR-26b的相對表達量。使用U6為內參基因，進行3次生物學重復，數據采用2-ΔΔCt法統計分析。將感染Ad后細胞中miR-26b的相對表達量標準化為1。見圖2。Western blot檢測β-catenin、p-β-catenin(S33/S37/T41)、activated β-catenin(ABC)蛋白表達的變化。結果顯示高表達miR-26b后ABC蛋白水平升高，p-β-catenin的蛋白水平下降，β-catenin總蛋白無變化。Wnt/β-catenin信號下游靶基因c-Myc，Runx2的表達升高。見圖3。

2.3 miR-26b上調MSCs細小FA數量、重組細胞骨架、縮小鋪展面積項目組通過重組腺病毒感染MSCs以高表達miR-26b，然后進行Paxillin免疫熒光染色以指示FA。統計顯示，每百個FA中小于25 μm的FA， Ad-26b組為(57.5±6.5)個，Ad組為(38.2±3.8)個，差異有統計學意義(t=25.63，P<0.05)。細胞高表達miR-26b后，細小FA數目增多，細小FA向細胞的前端周邊分布。說明miR-26b影響FA的大小及分布。見圖4。

miR-26不僅參與了細胞骨架重組和細胞遷移等活動，還參與細胞形態改變。通過Cellsens軟件分析MSCs的極性指數(長軸和短軸之比)、鋪展面積。結果顯示，細胞相對面積，差異有統計學意義(t=61.01，P<0.05)；極性指數，差異有統計學意義(t=64.41，P<0.05)。如圖5所示，高表達miR-26b后細胞面積變小，同時極性指數增大。實驗結果表明高表達miR-26b促使MSCs鋪展面積變小并且細胞呈現極性分布。

圖2 重組腺病毒感染MSCs 48 h后GFP及miR-26b的表達情況 ×400

圖3 miR-26b對β-catenin、p-β-catenin(S33/S37/T41)、activated β-catenin蛋白及Wnt/β-catenin下游靶基因c-Myc、Runx2的影響

2.4 miR-26b在不同分化狀態 MSCs中差異性表達在誘導分化7 d(B點)左右，MSCs逐漸失去其原有長梭形形態，向中心收縮、變短、變圓，誘導至14 d(C 點)左右，呈現多邊形或立方體形、核仁橢圓的肝細胞樣形態。誘導分化至21 d，細胞形態一致，立體感更強，邊界清晰，更為典型。免疫組化檢測，隨著分化時間的增加，細胞甲胎蛋白和角質蛋白19逐漸呈陽性表達。見圖6。qRT-PCR檢測誘導分化至7 d(B點)以后，細胞miR-26b表達開始增高，B、C、D點較分化前(A點)差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7。

2.5 miR-26b促進不同分化狀態MSCs趨化遷移經過6 h Transwell趨化遷移實驗，在顯微鏡100倍視野觀察遷移至小室下側的細胞數。分化至7 d的MSCs趨化遷移能力最強，較0、14、21 d組有差異；相同分化時間點，miR-26b組較Ad組遷移能力更強。見表2、圖8。

經過6 h Dunn chamber遷移實驗，分化至7 d(B點)組的MSCs平均遷移速率最高，較0、14、21 d組有差異；相同分化時間點，miR-26b組較Ad組遷移速率更高。見表3。

3 討論

本實驗探索了SD大鼠骨髓來源的MSCs在成肝樣分化過程中，不同分化階段以及在高表達miR-26b狀態下的趨化遷移特點。MSCs由于具有多向分化潛能，近年來MSCs移植治療給包括急慢性肝損傷和終末期肝病在內的許多疑難疾病患者帶來了新的希望。骨髓來源的MSCs因其具有容易獲得，易于擴增，體外多代次傳代培養生物學特性穩定等特點[6]，加之如果用于自身，不用擔心外源性病毒或腫瘤等的污染，更適合自體移植[7]。肝損傷后的自我修復過程中，包括HGF在內的許多炎癥因子表達增高。本研究顯示HGF能促進MSCs向病變部位的遷移，并促進其分化，這與Valente et al[8]和Shams et al[9]的研究結果一致。細胞移植中MSCs歸巢的數量與其遷移的能力密切相關，而歸巢的MSCs數量又與療效呈正比[10]。體內實驗研究證實只有少量MSCs遷移到了病變或損傷部位，療效非常有限。因此，提高 MSCs的分化和定向遷移能力，增加定植到損傷或病變部位的移植細胞數量，更好地發揮其獨特的生物學優勢，對改善療效至關重要。

圖4 miR-26b對MSCs FA大小的影響 ×1 000

表2 miR-26b對不同分化狀態MSCs趨化遷移的影響

圖5 miR-26b對MSCs鋪展面積、極性指數的影響 ×1 000與Ad組比較:*P<0.05

圖6 MSCs成肝樣誘導分化不同分化狀態細胞形態及甲胎蛋白和角質蛋白19的表達 ×200

圖7 MSCs成肝樣誘導分化不同分化狀態miR-26b的表達

表3 miR-26b對不同分化狀態MSCs遷移速率的影響

圖8 miR-26b對不同分化狀態MSCs趨化遷移的影響 ×100

Wnt/β-catenin信號通路與MSCs的遷移密切相關。文獻[11]報道，β-catenin入核是Wnt/β-catenin信號活化的重要標志。本研究顯示miR-26b高表達后可激活β-catenin (ABC)，促進其表達，并抑制Ser33/37/Thr41位點磷酸化的β-catenin的表達，從而使β-catenin的降解受到抑制，說明在MSCs中高表達miR-26b可激活Wnt/β-catenin 信號。Wnt/β-catenin信號通路激活后，β-catenin入核并結合TCF/LEF實現對下游靶基因的調控，從而影響各種生命活動。RT-qPCR結果顯示高表達miR-26b促進了c-Myc和Runx2的表達。所有這些結果都表明在MSCs中高表達miR-26b確實能夠激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進MSCs趨化遷移。

項目組還采用了成肝樣分化不同階段的MSCs作為研究對象，顯示在不同分化階段，miR-26b的表達量不盡相同。在前期的研究中，用基因芯片篩選出十幾個差異表達的miRNAs，其中包括表達上調的miR-26b。經定量PCR進一步驗證和下游信號分析表明miR-26b確實參與MSCs定向遷移的調控[5]。FA在細胞遷移的過程中始終處于一個組裝-解聚-再組裝的動態過程中，而細胞遷移的狀態與FA在細胞中的分布及大小密切相關[12]。FA由多種FA相關蛋白如樁蛋白及黏著斑激酶(FAK)等組裝形成[13]。miR-26b通過影響與MSCs遷移相關的片狀偽足中FA的大小以及MSCs鋪展面積、極性指數來調控遷移。高表達miR-26b使MSCs細小FA數目增多，細小FA向細胞的前端周邊分布。說明miR-26b影響FA的大小及分布；同時使MSCs細胞面積變小，極性指數增大，細胞呈現極性分布，這些都為提高MSCs的遷移能力提供了條件[14]。本研究顯示分化早期(7 d)的MSCs其趨化遷移能力最強，且遷移能力的強弱與miR-26b呈正相關。通過提高miR-26b的表達，可進一步提高MSCs的趨化遷移能力[15]。這為制備遷移能力更強的MSCs提供了實驗依據，為臨床MSCs移植采用何種分化狀態的細胞提供了參考。本研究表明miR-26b有助于促進MSCs成肝樣分化。但體內外由于微環境差異巨大，體外實驗可能并不能完全反映體內的情況，項目組后續將從體內動物實驗進一步明確miR-26b對MSCs的遷移、分化的影響，以期為MSCs對臨床肝病乃至其他疾病的治療提供實驗參考。