VEGFb參與白藜蘆醇促進面神經損傷大鼠神經再生

楊椋昕，鳳麟飛，李 芳，劉澤婷，王元銀

面神經麻痹是部分或完全喪失面神經功能，主要表現為面部表情肌群運動功能障礙，也稱為面癱[1]。當面部肌群癱瘓時，出現一系列感覺及運動障礙，如鼻唇溝消失，不能上提口角，眼瞼不能閉合，不能皺眉，額紋消失等。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然存在于食物中的多酚化合物，因其在控制氧化應激、炎癥和細胞死亡等多個靶點方面的益處而廣為人知[2]。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是Res對神經系統發揮有益作用的靶點之一[3]。Hermann et al[4]在兩項獨立研究中發現，Res提高了受損傷大腦中VEGF的表達水平，從而可能通過此緩解腦損傷。該實驗通過構建大鼠面神經損傷模型研究Res對于面神經損傷后的神經再生的作用及VEGF在其作用機制中所扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 實驗動物36只清潔級成年雄性SD大鼠，7～8周齡，體質量180～200 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，常規飼料飼養，自由飲水，溫度為22～25 ℃，12 h/12 h交替照明。

1.2 動物模型建立按隨機分組原則將大鼠分為2組，損傷組(Crush組)(n=24)和假手術組(Sham組)(n=8)。Crush組為該實驗主要研究模型，按照0.35 ml/100 g對大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行全身麻醉；麻醉顯效后，無菌條件下對大鼠右側面部進行解剖，切開皮膚，鈍性分離到達肌層，沿面神經走向解剖，到達面神經干部位分離面神經，使用持針器夾持面神經干90 s構建面神經損傷模型。Sham組同樣手術操作，但僅暴露面神經干，不進行損傷。兩組術后用3-0絲線常規進行皮膚傷口的縫合。Crush組大鼠再隨機分為3組：①對照組(Crush+Vehicle組)，損傷后僅使用對面神經損傷后無任何作用的鹽水；②白藜蘆醇組(Crush+Res組)，此組在損傷后使用Res(Cat V90038，美國Sigma-Aldrich公司)；③抑制劑組(Crush+Res+Axitinib組)，損傷后使用Res和VEGF信號抑制劑Axitinib(Cat S1005，上海Selleck公司)。

1.3 藥物注射對Crush+Res組與Crush+Res+Axitinib組大鼠按照200 mg/kg腹腔注射Res，對照組注射生理鹽水。Crush+Res+Axitinib組大鼠額外在右側面部耳屏前使用微量注射器局部注射10 μmol/L的Axitinib 10 μl。所有藥物注射，每日1次，持續10 d。

1.4 QPCR檢測VEGFb及受體mRNA含量大鼠連續注射藥物10 d后，通過腹腔過量注射10%水合氯醛致死。麻醉致死后剪下大鼠頭部，迅速切開右側皮膚取出右側面神經干，稱重后將其剪碎后按照每100 mg組織加入1 ml 的TRIzol試劑于勻漿器內充分研磨。使用NanoDropND-3OOO檢測各面神經組織樣本提取的mRNA濃度和純度，然后使用RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒內的逆轉錄反應體系制備cDNA進行PCR的擴增，反應參數為：預變性95 ℃、1 min，95 ℃、20 s，60 ℃、1 min，40個循環。各基因擴增的引物序列見表1，各組mRNA的相對表達量通過2-ΔΔCt進行計算。

表1 基因引物序列

1.5 Western blot檢測VEGFb及受體蛋白含量大鼠連續注射藥物10 d后，致死后同QPCR的手術操作采集面神經組織，稱重后在勻漿器中根據每100 mg加入1 ml RIPA裂解液(含1%PMSF)，充分研磨。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質后轉移到PVDF膜，用5%BSA(美國Sigma-Aldrich公司)在室溫下封閉1 h，將膜與稀釋抗體置于4 ℃冰箱內孵育過夜。使用的VEGFb抗體屬性為兔抗(1 ∶500, ab185696，英國Abcam公司)； VEGFR1抗體屬性為兔抗(1：500，ab2350，英國Abcam公司)；VEGFR2抗體屬性為兔抗(1 ∶400，26415-1-AP，美國proteintech公司)beta Actin抗體屬性為兔抗(1 ∶1 000，ab8227，英國Abcam公司)。按照1:5 000用二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗(#7074, 美國Cell Signaling Technology公司)，將膜置于二抗中在搖床上洗滌。參考相關說明書，使用ECL發光試劑盒來檢測蛋白。設置適宜的曝光時間進行化學發光反應。使用ImageJ軟件對曝光后的蛋白條帶圖灰度值進行統計分析。

1.6 免疫組化評估面神經損傷后神經再生情況大鼠連續注射藥物10 d后，致死后同QPCR的手術操作采集面神經組織，放入4%多聚甲醛(PA)溶液固定。隨后進行梯度脫水，將組織放入1×PBS溶液配制的10%、20%的蔗糖溶液依次浸泡2 h，最后放入1×PBS溶液配制的30%蔗糖溶液在4 ℃下過夜。梯度脫水后包埋切片，含驢血清的PBST孵育1 h，使用兔抗NF200 (1 ∶100, 美國Sigma-Aldrich公司)，在4 ℃下過夜。二抗標記使用的是含特定驢血清抗體的Alex Fluor 488 (1 ∶400, 美國杰克遜實驗室)，置于室溫下2 h。最后滴加熒光淬滅封片液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，計算機獲取數據，成像。

2 結果

2.1 大鼠術側面神經損傷后面神經情況通過免疫組化評估大鼠面神經損傷后的形態學變化，結果顯示，與Sham組相比，Crush+Vehicle組中NF200陽性的軸突數目明顯減少，表明神經纖維已被損傷，即模型的建立成功。與Crush+Vehicle組相比，Crush+Res組中NF200陽性的軸突數目更多，說明神經纖維發生再生，即Res具有促進面神經損傷后的再生作用(圖1)。

圖1 3組大鼠面神經損傷后免疫組化結果 ×20 A：Sham組；B：Crush+Vehicle組；C：Crush+Res組

圖2 各組大鼠中VEGFb、VEGFR1及VEGFR2的mRNA的表達水平

5.112、3.744、5.038)。以上的統計結果表明造模給藥10 d后，Res提高了面神經中VEGFb、VEGFR1及VEGFR2蛋白的表達水平，而Axitinib也有效地抑制了Res提高VEGFb、VEGFR1及VEGFR2蛋白表達的作用，差異均有統計學意義。見圖3。

2.4 Axitinib對大鼠術區面神經的神經再生作用的影響通過免疫組化評估Axitinib在大鼠面神經損傷后的作用，結果顯示，與Crush+Res組相比，Crush+Res+Axitinib組的NF200陽性軸突數目明顯減少，說明Res對神經再生的促進作用被Axitinib所抑制(圖4)。

3 討論

近些年來，Res在神經系統中的作用得到了廣泛的研究。Res具有多種作用于靶細胞、細胞生理學和信號傳導的藥理學作用。Res可能在不同的器官或細胞中對相同的靶點顯示出不同的效果。例如，Res已經被證明可以降低內皮細胞和腫瘤細胞中的VEGF表達。Res通過激活神經系統中的蛋白激酶B信號通路產生對神經的保護作用[5]，也有學者[6]證實Res可通過提高機體內蛋白激酶B磷酸化水平從而起到緩解腎臟損傷的作用。Res已被證明在治療各種類型的中樞神經系統損傷中具有神經保護作用，包括中風、創傷性腦損傷、蛛網膜下腔出血和脊髓損傷等。此外，Res在周圍神經損傷動物模型的治療中也顯示出了保護作用。例如Lindsey et al[7]發現Res通過長期給藥顯示出對受損視網膜神經節細胞樹突的保護作用。

圖3 各組大鼠面神經中VEGFb、VEGFR1和VEGFR2蛋白的表達水平

圖4 Crush+Res組和Crush+Res+Axitinib組面神經的神經再生情況 ×20A：Crush+Res組；B: Crush+Res+Axitinib組

VEGF是Res對神經系統發揮有益作用的靶點之一[3]，近年來許多學者將VEGF作為神經再生的有效中介進行研究。VEGF可支持和促進再生神經纖維的生長和神經元存活[8-9]。Raimondo et al[9]證實VEGF和胰島素樣生長因子1聯合應用可促進小鼠坐骨神經損傷模型中神經支配功能的恢復，與對照組相比，實驗組小鼠在神經損傷后表現出更強的運動能力。Ding et al[3]證實了使用Res 10 d后，與損傷組相比，Res組大鼠在一系列關于坐骨神經運動功能的檢測指標上都體現了運動功能的恢復。Ding et al[3]通過免疫組化發現，Res應用后促進了損傷后軸突的恢復和再生。其中，作為Res靶點之一的VEGF信號通路被激活，其中VEGFb和VEGFR1及VEGFR2蛋白和mRNA表達均提高。以上的研究結果提示在大鼠坐骨神經損傷模型中，Res可能是通過激活機體內的VEGF信號通路，提高了VEGFb mRNA與蛋白表達水平，最后達到促進神經再生以及運動功能恢復的作用。但是Res在面神經損傷模型中的作用及它是否影響VEGF相關的表達尚未得到研究。

本研究采用的是大鼠夾持損傷導致的面神經損傷模型，在面神經損傷后，使用Res可促進VEGFb與其受體VEGFR1和VEGFR2的表達，從而促進了神經再生的發生，且Res對于神經再生的有效作用可被VEGF抑制劑Axitinib所抑制。Res對于面神經損傷后的神經再生具有促進作用，且可能是通過激活機體內的VEGF信號通路使VEGFb和其受體VEGFR1和VEGFR2的mRNA和蛋白表達增加來實現這一作用。

本實驗參考Ding et al[3]的文章，后續希望能夠通過對Res使用劑量和時間的研究來完善補充Res和面神經神經再生之間的量效關系以及增加對照藥物的實驗來提高可信度及準確度。