槲皮素調控GSTP1甲基化抑制前列腺癌LNCap細胞增殖的機制研究

邢紅宇，朱明月，李 偉，林 波

前列腺癌是多發生在40歲以上成人的一種惡性腫瘤，男性惡性腫瘤前列腺癌發病率明顯升高，在新發現的確診病例中大多為局部晚期或廣泛轉移患者，主要以手術治療為主，化療、放療等其它療法為輔，無法根治性治療，預后較差[1-2]。谷胱甘肽S-轉移酶P1(glutathione S-transferases pi-1,GSTP1)具有保護細胞DNA堿基不受傷，抗腫瘤等功能。GSTP1表達沉默是正常前列腺上皮轉化為前列腺腺癌的標志[3]。槲皮素廣泛分布于植物中，具有多種生物作用，如抗氧化、清除自由基、抗感染、抗菌、抗病毒、免疫調節等作用[4]。GSTP1基因啟動子區Cp G島甲基化是藥物治療前列腺癌的重要有效靶點。針對GSTP1的靶向治療，探討槲皮素對前列腺癌細胞(prostate cancer cells,LNCap)細胞GSTP1啟動子甲基化的影響與LNCap細胞增殖機制的關系，為腫瘤靶向治療提供臨床醫療機制支持。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器酶標儀(型號: DG3022A)購自南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司；細胞培養箱(型號: J-80B-III)購自上海杰涵實驗設備有限公司；蛋白印跡儀(型號: PROFIBLOT 48) 購自北京博宇騰輝科貿有限公司；流式細胞儀(貨號: BeamCyte，1026)購自常州必達科生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(貨號:D190411)購自上海鈺博生物科技有限公司；RNA提取試劑盒(批號:D1937)、反轉錄試劑盒(批號:D1932)、PCR檢測試劑盒(批號:D1946) 購自哈爾濱經緯百科生物技術有限公司；RPMI-1640 培養基(批號:507739)購自美國GIBCO公司；胎牛血清(批號:11019-8634) 購自杭州億楓生物公司; EZ DNA Methylation-Gold KitTM甲基化試劑盒(貨號: D5005)購自北京天漠科技開發有限公司；膜聯蛋白V(異硫氰酸熒光素碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate propidium iodide,FITC /PI) 細胞凋亡檢測試劑盒(貨號: T2190)購自上海恒斐生物科技有限公司；槲皮素(Solarbio，批號: IQ0010 -1) 購自上海恒斐生物科技有限公司；LNCaP細胞(編號: C0787) 購自上海冠導生物工程有限公司。鼠抗GSTP1購自南京碧云天生物科技有限公司；兔抗β-肌動蛋白(β-actin)和辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠二抗均購自美國 Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1分組及處理 體外培養LNCap細胞，分為空白組、低濃度組、中濃度組、高濃度組及對照組。空白、低、中、高濃度組分別使用(0、10、40、80 μmol/L)槲皮素處理，對照組使用甲基轉移酶抑制劑5′-氮雜-2′-脫氧胞苷(5′- Aza-2′- deoxycytidine,5′-Aza-dC)(10 μmol/L)處理48 h。

1.2.2CCK-8檢測各組LNCap細胞增殖 從加入藥物處理開始，每隔12 h收集按實驗分組培養后的LNCap細胞消化離心，棄上清液，加MTT，孵育4 h，加入DMSO，按分組使用酶標儀檢測LNCap細胞懸液的吸光度(absorbance,OD490)值，計算各組LNCap細胞的抑制率=(1-實驗孔測定值)/對照孔測定值×100%，實驗3次，計算平均值。

1.2.3流式細胞術測定細胞凋亡率 收集按實驗分組培養后的LNCap細胞消化離心，調整濃度為1×106/ml的單細胞懸液，離心，孵育緩沖液洗滌，離心后用標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min后離心，孵育緩沖液洗滌，加入熒光溶液4 ℃下避光孵育20 min。取100 μl上流式細胞儀，流式細胞儀激發光波長用488 nm，波長515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，波長>560 nm的濾器檢測PI。檢測分析各組細胞凋亡情況。

1.2.4甲基化特異性PCR(MSP)檢測GSTP1啟動子區的甲基化狀態 通過測序驗證：按試劑盒操作步驟，收集LNCap細胞，提取各組細胞的DNA，以重亞硫酸鹽處理，將非甲基化的胞嘧啶(C)轉變為尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(C)不變。設計合成GSTP1甲基化(M) 與非甲基化(U) 引物。MSP反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳。同時采用MethyLight定量PCR法定量分析GSTP1甲基化水平，并以甲基化百分比參數表示。

1.2.5Real-time PCR檢測GSTP1轉錄水平 收集各組LNCap 細胞，裂解細胞后，按TRIzol試劑盒操作步驟提取細胞總RNA，設計各基因引物序列，內參基因β-actin，逆轉錄盒合成cDNA，檢測試劑盒檢測GSTP1 mRNA的基因表達，采用2-ΔΔCt法計算其相對表達量。

1.2.6Western blot檢測GSTP1蛋白水平 收集各分組LNCap細胞，裂解細胞后，取上清蛋白液，BCA盒測定分組細胞的蛋白含量。蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，結束后轉膜，加入GSTP1一抗，孵育過夜，清洗后加入二抗，進行孵育。設置內參β-actin蛋白，分析GSTP1蛋白，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶積分吸光度值/β-actin蛋白條帶積分吸光度值。

2 結果

2.1 槲皮素對LNCap細胞增殖能力的影響低、中、高濃度組細胞增殖抑制率隨槲皮素濃度增加和時間的增長而升高，差異有統計學意義(均P<0.05)。對照組細胞增殖抑制率在12、24、36、48 h時間均高于低、中濃度組，在36、48 h時間中均低于高濃度組，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

2.2 槲皮素對LNCap細胞凋亡的影響低、中、高濃度組細胞凋亡率隨槲皮素濃度增加而升高，差異有統計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，低、中濃度組細胞凋亡率降低，高濃度組升高，差異有統計學意義(均P<0.05)。見表2，圖1。

2.3 槲皮素對LNCap細胞中GSTP1啟動子區甲基化影響結果顯示，GSTP1基因在91 bp處出現甲基化條帶，93 bp處出現非甲基化條帶；在一定濃度范圍內隨著槲皮素濃度增加，LNCap細胞中GSTP1啟動子區的甲基化程度減弱(P<0.05)，差異有統計學意義。見表3、圖2。

表1 各組LNCap細胞增殖能力的情況

圖1 流式細胞術檢測結果

表2 各組LNCap細胞凋亡的情況

圖2 各組LNCap細胞中GSTP1啟動子區甲基化水平

表3 各組LNCap細胞中GSTP1啟動子區甲基化水平

2.4 槲皮素對LNCap細胞中GSTP1表達的影響低、中、高濃度組GSTP1和GSTP1mRNA相對表達量隨槲皮素濃度增加而升高，差異有統計學意義(均P<0.05)。與對照組比較，低、中、高濃度組GSTP1蛋白相對表達量降低，低、中濃度組GSTP1mRNA相對表達量降低，高濃度組GSTP1mRNA相對表達量升高，差異有統計學意義(均P<0.05)，結果見表4、圖3。GSTP1甲基化水平與GSTP1和GSTP1mRNA表達水平呈負相關(r=-0.900、-0.836，均P<0.05)。

表4 各組LNCap細胞中GSTP1表達情況

圖3 各組LNCap細胞中GSTP1蛋白表達

3 討論

前列腺癌患者早期排尿困難，之后逐漸出現局部疼痛壓迫癥狀，并向周圍組織浸潤[5]。在前列腺癌相關成纖維細胞中發現的DNA損傷修復基因沉默促進腫瘤進展[6]。GSTP1可主動保護細胞免受致癌物質和親電子化合物的侵害。GSTP1的沉默會增加細胞中DNA損傷，人前列腺癌LNCaP細胞中GSTP1被抑制表達，基因沉默[7-8]。而GSTP1 DNA甲基化的基因沉默是前列腺癌發生和正常細胞發展為侵襲性癌的腫瘤進展的機制，可作為前列腺癌的診斷指標[9]。

對于谷胱甘肽S-轉移酶(Glutathione S-transferase,GSTs)修飾的控制，活化的轉錄/翻譯控制是保護細胞免受氧化應激和癌癥發展傷害的重要機制[10-11]，筆者前期研究[12]研究表明，在人LNCaP細胞中減少GSTP1 CpG島的21個CpG位點的甲基化，誘導GSTP1的mRNA表達和蛋白表達可有效抑制癌細胞的發展。槲皮素是一種存在于水果、蔬菜等天然植物中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗感染、抗纖維化、抗腫瘤等作用[13]。眾多研究表明[14-15]利用槲皮素聯合化療藥物表現出抑制腫瘤生長和侵襲的作用，在腫瘤化學預防方面起著重要作用。

實驗結果顯示，在一定濃度范圍內隨著槲皮素用量增加，槲皮素可明顯抑制LNCap細胞生長增殖，減弱GSTP1啟動子區的甲基化程度；促進GSTP1mRNA和蛋白的表達，并對其有濃度依賴性。并且GSTP1 mRNA降低與GSTPl基因甲基化呈負相關。槲皮素可有效減弱LNCap啟動子甲基化程度，抑制LNCap細胞的生長增殖。

然而，由于槲皮素生物利用度低，水溶性低及在體內被快速代謝和酶降解清除，嚴重阻礙了槲皮素在臨床上的使用，因此，需要對槲皮素進行結構修飾，改善其水溶性及抗腫瘤活性。