基于生物信息學分析子宮內膜異位癥的潛在生物標志物和候選治療藥物

趙旭旭，趙衛東，張璟鶴，陳崢崢,任萍萍，張 影，葛 麗，于明月，朱美玲

子宮內膜異位癥(內異癥)是婦科常見的慢性、炎癥性、雌激素依賴性疾病，是導致育齡期女性出現盆腔疼痛、月經紊亂、組織粘連和不孕的主要原因[1]。其在育齡期女性中的發病率為5%～10%，困擾著全世界約1.76億女性[2]。內異癥確切的病因和發病機制尚不清楚，缺乏特異性的治療藥物。被廣泛接受的“經血逆流學說”認為有活性的子宮內膜組織可隨逆流經血進入盆腔，然后種植，形成內異癥。但經血逆流可發生在超過90%的輸卵管未閉的月經來潮女性中,而僅約10%的女性發病。鑒于異位內膜與正常內膜組織具有相似的組織結構和細胞組成，因此異位內膜細胞自身特性的改變可能是發病的重要原因。該研究旨在檢測正常內膜和卵巢內異癥的異位內膜兩組基質細胞的轉錄譜，并結合公共數據庫的基因表達譜數據，比較兩組細胞的基因表達差異，分析介導疾病的主要通路和功能，篩選致病的關鍵基因和潛在生物標志物，并尋找候選的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 病例資料2018年10月—2019年5月就診于安徽醫科大學附屬省立醫院，因卵巢內異癥行卵巢囊腫剝除手術的8例女性患者。對照組的正常內膜組織取自行子宮肌瘤手術的3例患者。選取的內膜組織均為晚期分泌期(最接近反流性子宮內膜)。納入標準：①22～43(33.7±6.2)歲；②未絕經，平素月經規律；③無子宮內膜炎。排除標準：①吸煙者；②有宮內節育器、慢性或免疫性疾病、凝血功能障礙和深靜脈血栓病史；③術前6個月內接受過抗感染、免疫抑制治療，激素治療或抗凝血劑等治療。患者的一般臨床資料見表1。所有的病理結果均由兩位副主任病理醫師共同診斷。本研究經安徽醫科大學附屬安徽省立醫院倫理委員會審核通過(2019-ky066)，并取得所有患者及其家屬的知情同意。

表1 入組患者的臨床資料

1.2 主要儀器及試劑DMEM/F-12購自美國Hyclone公司；FBS購自美國Gibco公司；Ⅳ型膠原酶和Ⅰ型脫氧核糖核酸酶購自美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B購自北京索萊寶科技有限公司；CD10抗體購自美國BD公司(PE/555375)；磁珠分選試劑盒和LS分離柱購自德國Miltenyi公司。

1.3 分離基質細胞分離基質細胞步驟如下：①無菌條件下采集的新鮮正常內膜和異位內膜組織，置于冰浴的含10%FBS及三抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素0.1 mg/ml，兩性霉素B 0.25 μg/ml)的DMEM/F-12培養液中，至實驗室分離；② 1×PBS洗3次，剪碎至直徑小于1 mm；③轉至含2.5 mg/ml的Ⅳ型膠原酶和50 U/ml的Ⅰ型脫氧核糖核酸酶的DMEM/F-12消化液中混勻，37 ℃消化40 min；④經100目篩網濾除未消化的組織,600 r/min、4 ℃離心10 min，去除混雜的白細胞和紅細胞； ⑤1×PBS沖洗基質細胞，重懸備用。

1.4 磁珠分選CD10陽性基質細胞磁珠分選CD10陽性基質細胞步驟如下：①對基質細胞離心計數，以40 μl/107個細胞的比例加入MACS buffer重懸；②吹勻懸液，以10 μl /107個細胞的比例加入10 μl CD10 biotin-antibody cocktail，混勻，4 ℃避光標記20 min；③MACS buffer洗1次，4 ℃離心；④以70 μl/107個細胞的比例加入MACS buffer重懸細胞，以20 μl/107個細胞的比例加入microbeads cocktail，4 ℃避光標記20 min；⑤加入MACS buffer洗1次，4 ℃離心；⑥MACS buffer重懸，過LS柱子；⑦用MACS buffer沖洗掛柱細胞，4 ℃離心，得到純化的CD10陽性基質細胞。

1.5 基因芯片數據的下載和處理純化的基質細胞，利用GPL6480(G4112F; Agilent)平臺檢測其全基因組表達譜。從基因表達譜綜合數據庫(GEO)篩得基于同平臺檢測分泌期正常內膜和異位內膜基質細胞的GSE120103和GSE3783兩組芯片，補充9個正常內膜組織(GSM3393491-GSM3393499)和14個異位內膜組織(GSM3393500-GSM3393508，GSM928792，GSM928800，GSM928806，GSM928808，GSM928810)。依次用Robust Multiarray Average和sva package對3組芯片的原始數據進行預處理并消除批次差異，得到歸一化的標準數據。采用limma軟件包和經驗貝葉斯方法篩選差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)，其中P<0.05，|log2Fold-change|≥1.0的基因被認為表達顯著差異。芯片數據可從GEO數據庫中獲取(GSE132464)。

1.6 差異基因的功能富集分析結合基因本體(GO)數據庫和京都基因與基因組百科全書(KEGG)數據庫，利用clusterprofiler軟件包對DEGs富集通路和功能進行分析和可視化展示。符合錯誤發現率(FDR)<0.05且P<0.05的條件，被認為是差異有統計學意義的顯著富集。

1.7 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建將差異基因提交到在線數據庫STRING(https://string-db.org/)，得到PPI數據。選擇綜合得分>0.7的PPI節點構建PPI網絡。利用生物信息學軟件Cytoscape v3.4.0(http://www.cytoscape.org/)分析候選蛋白的交互關系，對各節點蛋白相互作用蛋白數目進行排序，篩選出核心靶點。

1.8 類藥物小分子化合物的篩選將差異基因分為上、下調兩組，分別輸入關聯性圖譜(CMAP, http://www.broadinstitute.org/cMAP/)數據庫檢索。比較差異基因與CMAP中小分子干擾基因的表達模式相似性，識別出與疾病相關的小分子化合物。P<0.001且mean絕對值>0.5的小分子被認為與疾病顯著相關。

1.9 統計學處理使用GraphPad Prism 8.0統計數據和做圖。所有的數據均使用雙尾非配對t檢驗進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異位內膜和正常內膜組織中DEGs的篩選為篩選異位內膜和正常內膜組織中DEGs，以P<0.05，|log2Fold-change|≥1.0為條件，對25個樣本(10個正常內膜、15個異位內膜)中18 690個基因的表達數據進行篩選。共篩得869(4.6%)個差異表達基因，包括17個上調基因和852個下調基因。見圖1A。利用R語言gplots包對差異基因進行聚類分析并可視化。見圖1B。

2.2 異位內膜組織中DEGs的功能注釋和通路富集為探究異位內膜組織中差異基因的功能，對其進行GO和KEGG功能注釋。GO富集分析顯示前10位變化條目包括受體配體活性、通道活性、被動跨膜轉運蛋白活性、DNA結合轉錄激活因子活性和RNA聚合酶Ⅱ特異性、底物特異性通道活性、離子通道活性、離子門控通道活性、門控通道活性、細胞因子活性、神經遞質受體活性。見圖2A。其中，僅DNA結合轉錄激活因子活性和RNA聚合酶Ⅱ特異性在病灶中被上調。KEGG通路富集分析發現，神經活性配體-受體相互作用通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、IL-17信號通路、破骨細胞分化通路、金黃色葡萄球菌感染通路、尼古丁成癮通路出現功能紊亂。見圖2B。結果表明異位內膜組織可能通過這些顯著富集的功能條目和通路機制參與疾病的發生、發展。

2.3 異位內膜組織中差異基因PPI網絡的構建為深入挖掘異位內膜組織中核心的致病基因和潛在的生物標志物，將全部差異基因輸入STRING數據庫預測它們之間的相互作用網絡。見圖3A。根據各網絡節點的度(degree，表示網絡中和節點相連路線的條數)篩選出與其他節點蛋白相關性最強的8個核心基因，包括甲酰肽受體2(formyl peptide receptor 2，FPR2)、血清淀粉樣蛋白A1(serum amyloid A1，SAA1)、松弛肽3(relaxin-3，RLN3)、細胞介素8(C-X-C motif chemokine 8，CXCL8/IL8)、甲酸基肽受體1(formyl peptide receptor 1，FPR1)、血小板因子4(platlet factor 4，PF4)、趨化因子受體7(C-C chemo-kine receptor type 7，CCR7)和趨化因子配體5(C-X-C motif chemokine 5，CXCL5)基因。與其相互作用的關系對和基因如表2所示。利用小提琴圖比較8個關鍵基因的表達變化，結果顯示它們在異位病灶中均下調，以FPR2、SAA1和CXCL8基因的下調最顯著(t=3.537、P=0.001 8；t=2.995、P=0.006 5；t=2.187、P=0.039 2；t=3.020、P=0.006 1；t=2.256、P=0.033 9；t=2.775、P=0.010 8；t=2.178、P=0.039 9；t=2.258、P=0.0337)。見圖3B。這些核心基因可能在異位內膜病灶的形成中起關鍵作用，有望成為內異癥潛在的生物標志物。

圖1 差異基因的篩選和聚類分析

圖2 差異基因的功能注釋和通路富集分析

2.4 與內異癥疾病相關的類藥物小分子的篩選為尋找治療內異癥的候選藥物小分子，并為進一步實驗驗證提供理論依據，將異位內膜組織的差異基因表達譜與CMAP數據庫進行比對。包括Prestwick-692、硫代羅寧、氟硝利嗪、苯海索和喹吡羅在內的5個小分子化合物與內異癥的關聯性最強(表3)。其中，硫代羅寧和氟硝利嗪與病灶中的差異基因具有相反的作用機制，是拮抗內異癥的潛在小分子化合物。而Prestwick-692、苯海索和喹吡羅與內異癥某些生物過程或狀態有相似的關系，與發病可能有類似的作用機制。硫代羅寧和氟硝利嗪的化學分子式、作用機制和臨床應用見表4。

圖3 核心差異基因的篩選及表達差異分析

表3 CMAP數據庫篩選出的關聯度最強的5種小分子化合物

表4 負相關小分子化合物的作用機理及應用

3 討論

異內癥作為一種慢性炎癥性疾病，可引起嚴重的慢性疼痛(痛經、性交困難、腹痛)和一系列生殖問題，長期困擾著世界各地數以百萬計的女性。盡管越來越多的證據表明遺傳、內分泌、免疫、微生物和環境因素與異內癥的發病相關[1]，但明確內異癥的病因、發病機制和開發特異性治療藥物仍是難點。

本研究表明異位內膜和正常內膜的基因表達譜整體相似，僅少部分基因差異表達，以下調基因為主。在異位內膜病灶中受體配體活性、細胞因子活性和神經遞質受體活性的改變可能介導疾病的發生和疼痛的調節，神經活性配體-受體相互作用通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用通路和IL-17信號通路等通路的調控紊亂也與疾病發生密切相關，這與之前的研究相符[3]。深入分析病灶中的基因改變，FPR2、SAA1、RLN3、CXCL8、FPR1、PF4、CCR7和CXCL5共8個基因被認為是關鍵的致病因素，是內異癥潛在的生物標志物。本研究首次顯示SAA1在人內異癥病灶中的表達降低。已有研究表明SAA是由肝細胞產生和釋放的一種急性期蛋白，參與維持黏膜組織中的免疫平衡，在肉牛子宮內膜的正常和炎癥狀態中均表達[4]。炎癥消退后SAA1的高表達被認為參與了子宮內膜組織中免疫平衡的重建，因此，人內異癥中低表達的SAA1可能反應了組織中的炎癥狀態[4]。與Volpato et al[5]的研究一致，本研究顯示，在分泌晚期異位內膜中FPR2和FPR1的表達水平均降低。膜粘連蛋白A1激活甲酰基肽受體2 /阿司匹林觸發脂蛋白(FPR2/ALX)可誘導M1型巨噬細胞向M2型分化，并減弱病灶中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達。阻斷FPR1和FPR2/ALX以及缺乏ANXA1都可導致腹腔血管平滑肌細胞中IL-6的生成增多，而IL-6水平與NK細胞的溶細胞活性呈負相關，其在降低內異癥患者腹腔液中NK細胞的活性起至關重要的作用，有助于異位內膜細胞的存活和植入[5]。已有報道[6-7]稱內異癥患者的血清和腹腔液中CXCL8的表達均升高，CXCL8可通過促進血管生成和內膜細胞的附著、生長，在疾病發生中發揮作用。而該研究結果表明異位內膜組織中CXCL8的表達水平相較正常內膜下降。考慮到包括CXCL8在內的多種趨化因子配體可介導體內多種復雜的調控網絡，如IL-1β和TNF-α通過誘導p38 MAPK信號通路可介導CXCL8在異位內膜中的表達[6]，因此，CXCL8在內異癥中的價值仍需進一步驗證。先前的研究[8]顯示宮腔粘連的子宮內膜組織中CXCL5蛋白水平明顯降低，CXCL5的表達在維持正常內膜的功能、抑制宮腔粘連形成中具有重要作用。因此，CXCL5在異位內膜病灶中的下調表達可能與內膜組織的損傷和粘連功能改變有關。CCR7被報道[9]在內異癥中的表達升高，CCL19/CCR7軸可通過PI3K/AKT信號通路介導子宮內膜基質細胞中B 細胞淋巴瘤因子2(BCL2)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)和基質金屬蛋白酶9(MMP9)的表達，促進內膜基質細胞的增殖和侵襲。該研究結果與之相反，提示可能有其他通路途徑參與調控CCR7在異位內膜病灶中的表達。RLN3是一種肽激素，可通過G蛋白偶聯受體信號傳導途徑介導人子宮內膜基質細胞的蛻膜化[10]。目前尚無關于內異癥中RLN3和PF4的研究報道。

治療內異癥，臨床常推薦的避孕藥、高效孕激素以及促性腺激素釋放激素激動劑 (GnRH-a)等多伴隨一系列副作用，因此開發特異性強的靶向藥物具有重要價值。篩得的硫代羅寧和氟硝利嗪被認為是拮抗內異癥的潛在藥物。硫代羅寧作用靶點包括甲狀腺激素受體α蛋白、β蛋白和增殖細胞核抗原蛋白。細胞增殖已被證實在內異癥中起至關重要的作用，藏紅花素可通過靶向增殖細胞核抗原的表達抑制內異癥的生長[11]。因此，硫代羅寧可能具有類似藏紅花素的功能——治療內異癥。氟硝利嗪的作用靶點包括電壓依賴性T型鈣通道亞基α-1G、-1H、-1I蛋白和組胺H1受體蛋白以及鈣調蛋白。相比于正常內膜，異位內膜組織中鈣調蛋白表達增高，其可通過鈣調蛋白激活鈣調磷酸酶/活化T細胞核因子通路介導COX-2的表達，參與內異癥中異位內膜組織的增殖[12]。因此，作用于鈣調蛋白的靶向劑氟硝利嗪可能在治療內異癥中具有潛在價值。

該研究使用生物信息學分析方法探究了內異癥中多功能、多通路、多靶點的復雜致病因素，為進一步篩選疾病相關的生物標志物，闡明發病機制和開發靶向藥物提供了新思路。