2型囊泡單胺轉運體分子探針18F-FP-(+)-DTBZ縱向定量評價2型糖尿病大鼠腦多巴胺能神經元

姜東朗，潘智偉，肖見飛，黃 琪，任樹華，華逢春，管一暉，謝 芳

(復旦大學附屬華山醫院PET中心，上海 200235)

糖尿病(diabetes mellitus， DM)和帕金森病(Parkinson disease， PD)是威脅人類健康的常見慢性疾病，發病率均呈逐年上升趨勢[1]。DM與PD之間可能存在緊密聯系[2-4]，但具體機制尚未明確。2型囊泡單胺轉運體(vesicular monoamine transporter 2， VMAT2)靶點正電子探針可用于評估多巴胺能神經元功能[5]。本研究應用VMAT2靶點分子探針18F-FP-(+)-DTBZ對2型DM(type 2 DM， T2DM)大鼠行PET/CT顯像，觀察T2DM對腦多巴胺能神經元的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 12只Zucker Diabetic Fatty(ZDF)雄性大鼠，SPF級，8周齡，體質量200～300 g，購自北京維通利華有限責任公司，許可證編號：SCXK(京)2016-0006，分為T2DM組(基因型fa/fa)和對照組(基因型fa/+)，每組6只。

1.2 建立T2DM模型 大鼠飼養于復旦大學實驗動物中心清潔級動物房，室溫21oC，相對濕度50%，光照明暗周期12 h，分籠喂養，自由采食與飲水。予T2DM組高脂飼料飼養，對照組普通維持飼料喂養。飼養2周后經尾靜脈取血，以Roche血糖儀測量T2DM組大鼠隨機血糖，連續2次隨機血糖≥11.1 mmol/L提示建模成功。

1.3 儀器與方法 采用Siemens Inveon Micro-PET/CT掃描儀，掃描參數：PET有效橫向FOV 10 cm，軸向FOV 12.7 cm，空間分辨率1.4 mm，管電壓80 kV，管電流500 μA。放射性示蹤劑18F-FP-(+)-DTBZ由復旦大學附屬華山醫院PET中心自主制備，符合藥品生產質量管理規范[6]，放射化學純度>99%，內毒素小于0.5 IU/25 mg；其他質量控制參數均符合要求，適用于活體注射[7]。于大鼠3、6和12月齡時測量其體質量及空腹血糖；于麻醉箱內以異氟烷與氧氣混合氣體(3∶1)誘導麻醉，成功后將大鼠以仰臥位保定于掃描床上，以異氟烷與氧氣混合氣體(2∶1)維持麻醉，觀察無異常反應后，經尾靜脈注射顯像劑10 μCi/g。 60 min后行3D模式腦部顯像10 min，采用同機CT衰減矯正。于Inveon工作站采用OSEM 3D方式重建圖像，迭代次數2，分辨率1.5 mm，Zoom為1，矩陣為128×128。

1.4 圖像分析 采用PMOD 4.0圖像分析軟件，基于軟件地圖集進行圖像融合，共獲得58個ROI，包括紋狀體、小腦、杏仁核、海馬體、下丘腦、嗅球及丘腦等。根據紋狀體區域標準攝取值(standardized uptake value， SUV)值與小腦SUV比值計算紋狀體標準攝取比值(standardized uptake value ratio， SUVR)。

1.5 統計學分析 采用Prism 8統計學分析軟件。計量資料用±s表示，以雙因素方差分析比較2組大鼠各時間點體質量、空腹血糖、紋狀體SUVR及組內各時間點血糖。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量及血糖水平 2組大鼠3～12月齡體質量均有所增長；6月齡時T2DM組體質量明顯高于對照組(P<0.05)，而3月及12月齡時差異均無統計學意義(P均>0.05)。組間比較，T2DM組大鼠第6個月和12個月空腹血糖均明顯高于對照組(P均<0.05)；第3個月差異無統計學意義(P>0.05)。對照組大鼠空腹血糖較穩定，各時間點差異均無統計學意義(P均>0.05)。組內比較，T2DM組大鼠3～12月齡空腹血糖逐漸增高，12月齡時達最高水平，明顯高于3月(P<0.01)及6月齡時(P<0.05)，其余時間點組內差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

2.2 紋狀體SUVR T2DM組大3和6月齡時腦紋狀體SUVR與對照組差異均無統計學意義(P均>0.05)，12月齡時明顯低于對照組(P<0.05)；12月齡時的SUVR明顯低于6月齡(P<0.01)，6和12月齡時SUVR均高于3月齡時(P均<0.05)。對照組大鼠6和12月齡時腦紋狀體SUVR均明顯高于3月齡時(P均<0.05)，6與12月齡時差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1及表2。

3 討論

既往研究[3，8]發現多種降糖藥物治療PD均有較好效果，T2DM與PD之間存在較多相同病理生理學機制，如線粒體功能障礙、內質網應激、炎癥反應、維生素D減少及泛素-蛋白酶和自噬-溶酶體系統功能異常等。DM是PD發病的獨立危險因素[9-10]，但具體作用機制尚未明確。

表1 2組大鼠各時間點體質量及血糖水平比較(±s)

表1 2組大鼠各時間點體質量及血糖水平比較(±s)

注：*：與3月齡時血糖水平比較，P<0.01；#：與6月齡時血糖水平比較，P<0.05

組別體質量(g)3月齡6月齡12月齡血糖(mmol/L)3月齡6月齡12月齡T2DM組(n=6)267.20±9.42454.33±55.88402.33±19.457.98±2.1710.58±3.0015.63±5.85*#對照組(n=6)202.00±5.70380.17±18.84442.67±87.523.88±1.375.95±0.755.40±0.49t值2.262.821.532.483.076.05P值0.090.030.360.060.01<0.01

圖1 2組大鼠腦18F-FP-(+)-DTBZ PET圖 6月齡時紋狀體SUVR最高，12月齡時紋狀體SUVR低于6月齡而高于3月齡時

表2 2組大鼠各時間點紋狀體SUVR比較(±s，n=6)

表2 2組大鼠各時間點紋狀體SUVR比較(±s，n=6)

注：*：與3月齡時比較，P<0.05；#：與6月齡時比較，P<0.01

組別3月齡6月齡12月齡T2DM組2.20±0.323.18±0.21*2.68±0.24*#對照組2.49±0.223.51±0.28*3.46±0.23*t值1.462.335.44P值0.400.08<0.01

PD是由黑質致密部多巴胺能神經元丟失引起的神經退行性疾病。目前針對PD的正電子分子探針主要包括以多巴胺轉運體(dopamine transporter， DAT)、反映多巴脫羧酶活性、突觸囊泡上VMAT2及多巴胺受體D1和D2為靶點的各種顯像劑。本研究以VMAT2靶點分子探針18F-FP-(+)-DTBZ對T2DM大鼠行PET/CT顯像，旨在觀察T2DM對腦多巴胺能神經元的影響。VMAT2主要分布于中樞神經系統的多巴胺能、去甲腎上腺素能及5-羥色胺能等神經元突觸末梢內，是位于突觸囊泡膜上的轉運蛋白，負責轉運多巴胺至囊泡內。相關研究[11]證實，黑質-紋狀體投射通路中，90%以上VMAT2陽性神經纖維屬于多巴胺能。VMAT2是中樞內多巴胺能神經元的重要載體，可反映多巴胺能神經元功能。PETRISIC等[12]發現DM動物模型腦內DAT表達水平明顯下降。胰島素功能與DAT和酪氨酸羥化酶的水平密切相關，胰島素通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B， PI3k/AKT)通路調節DAT水平，胰島素缺乏可致DAT功能障礙[13-15]。本研究中12月齡時T2DM組紋狀體SUVR明顯低于對照組(P<0.05)，提示高血糖可下調腦紋狀體VMAT2表達，引起多巴胺能神經元功能異常。

本研究所用ZDF大鼠為目前制備T2DM模型時應用較多的動物。研究[16]表明，雄性ZDF大鼠7周齡前表現為進行性肥胖、高脂血癥及胰島素抵抗，此階段其胰島β細胞數量約為對照組的2倍，功能已出現異常；8周齡后胰島β細胞數量逐漸減低，胰島形態高度混亂，伴明顯纖維化，空腹血糖隨血漿胰島素水平降低而逐漸升高；其體質量增長速度降低與血漿胰島素減少和空腹高血糖升高時間相符合[17]。本研究T2DM組大鼠體質量于6月齡時達到最高，之后逐漸降低；3～12月齡空腹血糖呈逐漸上升趨勢，與既往報道基本一致。

本研究中，T2DM組大鼠12月齡時紋狀體SUVR明顯低于對照組(P<0.05)，6月齡時較對照組呈下降趨勢，結合同期2組血糖水平，提示血糖增高可不同程度降低腦內VMAT2表達水平；T2DM組大鼠12月齡時紋狀體18F-FP-(+)-DTBZ攝取較6月齡時明顯下降(P<0.05)，此時對照組大鼠僅輕度減低(P>0.05)，提示T2DM可能加劇腦VMAT2表達降低。CEREDA等[18]發現，確診PD前已罹患T2DM者運動癥狀損害較未合并T2DM的PD患者更為嚴重，且需要更大劑量左旋多巴藥物治療，本研究結果與其相符。2組大鼠6和12月齡時紋狀體18F-FP-(+)-DTBZ攝取均較3月齡時明顯增高(P均<0.05)，可能與大鼠腦發育相關[7]。

T2DM引起腦內VMAT2表達降低的可能原因如下：①胰島素抵抗或胰島素缺乏導致多巴胺能神經功能異常。中樞神經系統內黑質與多巴胺能神經元存在較多的胰島素受體，且胰島素可透過血腦屏障，二者結合可使胰島素受體底物磷酸化，激活下游PI3k/AKT等通路。腦內出現胰島素抵抗可能與外周胰島素水平增加導致其腦內水平增高、進而使胰島素受體底物表達下調及下游信號通路受損相關。胰島素可調控多巴胺能神經元相關mRNA的表達，故腦內胰島素缺乏也可引起多巴胺能神經功能異常。MORRIS等[19]發現，與對照組相比，高脂肪飲食喂養的胰島素抵抗大鼠多巴胺釋放減弱、清除率降低，提示胰島素抵抗可損害黑質紋狀體多巴胺功能。②高血糖導致的多巴胺能神經損傷。正常情況下葡萄糖是腦組織唯一能量來源，能量代謝障礙可致腦功能受損。XIE等[20]觀察高血糖狀態下多巴胺能神經元細胞模型，發現高血糖引起的丙酮醛增高可損傷多巴胺能神經元，丙酮醛可與多巴胺反應，產生1-乙酰基-6，7-二羥基-1，2，3，4-四氫異喹啉(1-acetyl-6,7-dihydroxyl-1,2,3,4-Tetrahydroisoquinoline， ADTIQ)，誘導多巴胺能細胞中的線粒體凋亡[21]。

綜上所述，T2DM可降低大鼠腦內多巴胺能通路中VMAT2的表達，提示糖尿病對腦多巴胺能神經功能存在影響，為進一步研究T2DM和PD關聯機制提供了新的實驗依據。