慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細胞對23價肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗的反應

王振國 黃譯瑩 涂常力 鄭曉濱

(中山大學附屬第五醫院呼吸內科，廣東 珠海 519000)

多年來，對肺炎球菌感染的控制主要著眼于早期診斷及抗生素治療，這在一定程度上改善了疾病的預后，但未能減輕疾病造成的整體經濟負擔，并使得細菌耐藥性增高〔1〕。近20年來，醫學界認識到該病的控制需要一種能對公共衛生產生廣泛影響的預防策略，并為達到這個目標而多方努力地尋找一種有效的抗肺炎鏈球菌疫苗〔2〕。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是成年人最常見的慢性疾病之一，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關，致殘率和病死率很高，將成為全球第3次致死病因，并且隨著社會的老齡化及環境污染的加劇，COPD的患病率還將持續上升〔3～5〕。目前使用的 23 價肺炎球菌莢膜多糖疫苗(PPV23)是1983年批準上市的，建議用于高危成人及老年人。PPV23在高齡老年人及COPD病人中的臨床有效性仍有爭議，盡管大多數的病例對照及非直接隊列研究均提示對侵襲性肺炎球菌病有一定的效果，前瞻性的臨床試驗及其 meta 分析均未能證明 PPV23在普通老年人及 COPD 病人中對肺炎球菌肺炎有顯著的保護作用〔6～10〕。而循證醫學協作組報告，雖 PPV23未能減少老年病人的肺炎發病率及相關性死亡，從觀察性研究獲得的證據表明 PPV23預防成人及非免疫缺陷老年人(≥65 歲)侵襲性肺炎球菌疾病(IPD)的有效性達 53%〔11〕。因此，Ochoa-Gondar 等〔9〕認為，接種PPV23在老年慢性肺病患者應答較差，有效性較低，但鑒于老年慢性肺病患者侵襲性肺炎球菌感染的后果及經濟負擔重，又缺乏更有效的疫苗，仍建議在這個人群中使用。由于 COPD 病人對PPV23免疫應答的現有研究結果不一致，本研究通過觀察不同人群外周血單個核細胞(PBMC)對肺炎鏈球菌莢膜多糖反應，從而評估不同人群對PPV23主動免疫應答的真實情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 以65歲為界分為老年及成人兩個亞組。成人COPD組15例，來自中山大學附屬第五醫院呼吸內科門診COPD穩定期患者，男9例，女6例，年齡35～52歲，平均(44.5±10.7)歲，符合中華醫學會呼吸病協會制定的COPD診斷標準；老年COPD組15例，來自中山大學附屬第五醫院呼吸內科門診COPD穩定期患者，男10例，女5例，年齡66～82歲，平均(72.3±6.2)歲，符合中華醫學會呼吸病協會制定的COPD診斷標準；健康成人組15例，男8例，女7例，年齡23～48歲，平均(28.4±8.6)歲，為中山大學附屬第五醫院體檢為健康者。健康老年組15例，男8例，女7例，年齡66～78歲，平均(68.8±5.6)歲。排除標準：患有其他肺部疾病，嚴重的心功能不全，慢性肝、腎疾病，惡性腫瘤，自身免疫性疾病，先天性或獲得性免疫缺陷，接受系統性免疫調節或免疫抑制治療(包括口服糖皮質激素)。無脾或脾切除術后。曾經注射過肺炎鏈球菌疫苗。近1個月內有感染性疾病病史。

1.2主要試劑及儀器 PPV23(紐莫法)(美國默沙東公司)；小牛血清(杭州四季清公司)；RPMI-1640(Gibco公司)；4-(2-羥乙基)-1哌嗪乙磺酸(HEPES)(MD公司)；淋巴細胞分離液(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)；電熱恒溫干燥箱(寧波市鄞州邱隘佳諾自動化儀表廠)；環氧乙烷滅菌鍋(泉暉貿易國際有限公司)；XK97-2型雙向恒溫攪拌器(姜堰市新康醫療器械公司)；24孔培養板(美國Corning公司)；HERA Cell CO2培養箱(德國Heraeus公司)。

1.3實驗方法

1.3.1PBMC的分離 ①所有受試者取外周靜脈血10 ml，生理鹽水10 ml稀釋。②標記各離心管，向10 ml離心管中加入3 ml 淋巴細胞分離液，加入稀釋后的靜脈血。1 700 r/min離心20 min以分離細胞。③吸出PBMC及部分血清，置另一潔凈離心管中。向離心管中加入6 ml NS液，混勻。1 000 r/min離心10 min 洗滌1次。倒置離心管，甩干上清，加入完全培養基1 ml吹打管底細胞混勻。

1.3.2PBMC的干預培養 ①PBMC加入24孔板。設干預組及對照組，各培養組均設3個復孔，每孔細胞懸液PBMC數為1.5×106個，體積為800 μl。②在含5%CO237℃培養箱培養24 h后，取上清液測抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性免疫球蛋白(Ig)G、IgM抗體。并于抗原刺激孔添加稀釋疫苗溶液200 μl(PPV23終濃度為0.115 μg/ml)，對照孔添加生理鹽水200 μl，總體積均為1 ml，吹打混勻細胞懸液。在含5%CO237℃培養箱繼續培養48 h，再取上清液測抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性IgG、IgM抗體。

1.3.3間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測步驟〔12,13〕①包被：將11.5 μg/ml PPV23包被于聚苯乙烯ELISA板中，2孔加入不含疫苗的抗原稀釋液作為背景孔(無抗原孔)，加蓋封板膜，4℃冰箱過夜。②加實驗室參考血清和待測樣本：加入PBMC培養上清液及倍比稀釋的實驗室參考血清(8個濃度)，每孔50 μl，均設復孔,留2孔加入抗體稀釋液(無血清孔)。于溫育箱中37℃溫育60 min。③加酶標工作液：加入稀釋至工作濃度辣根過氧化酶標記羊抗人IgG或IgM或IgA，每孔100 μl，留2孔加入抗體稀釋液(無二抗孔)。于37℃溫育箱中溫育60 min。④洗板：每次加洗滌液充分洗滌5次并充分拍板。⑤顯色：每孔先加入顯色劑 A 液(TMB) 50 μl，再加入顯色劑 B 液(H2O2)50 μl，溫育箱中溫育30 min。⑥終止：取出酶標板，每孔加終止液50 μl，終止反應(顏色由藍色立轉黃色)。⑦酶標儀讀值：終止反應后15 min在450和630 nm處的酶標儀雙波長上讀出反應孔的吸光度值。⑧計算：測定OD值=復孔算術平均值-最高空白對照值，最高空白對照值應控制在0.01以下。根據倍比稀釋的實驗室參考血清的濃度及對應的 OD 值，使用CURVEEXPERT軟件來計算出標準曲線回歸方程，再根據樣本的 OD 值(取復孔平均值)，在回歸方程上計算出對應的樣品血清濃度與實驗室參考血清抗體濃度的比值。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。

2 結 果

2.1PBMC體外培養上清液抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度(相對參考血清的抗體濃度比值×10-3) 4組PMBC在體外培養24 h后，疫苗干預前各組間抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體IgG、IgM的產生無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 疫苗刺激前各組抗體濃度的比較

2.2PPV23干預培養48 h后各組抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度的比較(相對參考血清的抗體濃度比值×10-3) 加PPV23培養48 h后，對比疫苗刺激前，對照組及干預組各組的抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體均較前有下降。與對照組相比，疫苗刺激后4個干預組的抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度均明顯升高(P<0.05)。但是疫苗刺激后各分組間抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體IgG、IgM的產生無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 疫苗刺激后各組抗體濃度的比較

3 討 論

肺炎鏈球菌感染是一個世界性問題，大于65 歲的老年人是罹病風險最高的人群之一，尤其是當患者合并有高危因素時。COPD 也是肺炎鏈球菌感染的常見高危因素。肺炎球菌莢膜多糖疫苗被建議用在老年人及COPD 病人，但其有效性一直存在爭議。有關老年人及COPD 病人對疫苗應答差的原因，可能與免疫老化有關，并可能與機體老化過程中出現的免疫系統改變有關。臨床上對COPD患者的常規治療主要包括抗感染及解痙平喘氧療等對癥處理，隨著肺炎鏈球菌耐藥率的不斷提高，COPD患者抗感染治療的效果也不盡理想。為了減少COPD的急性發作，推薦對COPD患者進行常規PPV23接種〔14〕。國外報道指出，接種PPV23 COPD患者的死亡率、并發癥、住院天數、發生呼吸衰竭的危險較低均較未接種者有下降〔15〕。

COPD患者多在40 歲以后出現癥狀。COPD 病人的主要呼吸生理改變也見于老年人，如小氣道阻塞、肺彈性下降及動態過度膨脹，且COPD 的發病率隨年紀而增加，提示機體老化可能是COPD 促進因素，或COPD 是機體加速老化的表現，與機體老化相關的免疫系統重塑在慢性炎癥性疾病的發病中起重要的作用。有學者認為COPD 不過是外界毒性刺激物觸發的加速的機體老化的一種表型〔16,17〕。有研究表明。隨著年齡增長，老年人免疫反應有所下降。對比健康成年人，老年人對疫苗的免疫反應有一定程度的降低〔18〕。

抗體的產生需要許多的信號和最適的認知的相互作用，例如抗原提呈細胞、T細胞和B 細胞的受體參與。從外周血分離的PBMC是包含了這些細胞的。本研究結果顯示，PPV23干預培養48 h后各組抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度均較前有下降，考慮是隨著體外培養的時間增加抗體代謝消耗所致。而經過PPV23刺激后，結果表明，人的PBMC仍有活力，可以繼續分泌抗體。

血清的抗體水平并不能準確地代表最近免疫應答，由于以前對抗原的暴露，可產生可溶的抗體，血清的抗體水平包括這些累積的可溶的抗體。我們的方法取PBMC,檢測其上清液分泌的抗體，更好地代表了宿主對疫苗的免疫應答。