蛋白質羰基化與慢病伴發的骨骼肌萎縮

孔文文 張昕

(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院心功能科，內蒙古 包頭 014010)

慢性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、癌癥等老年慢性病患者晚期均可能伴發惡病質，其特征是體重減輕及骨骼肌功能障礙。無論這些老年患者基礎的心肺功能如何，其骨骼肌功能障礙和肌肉受損的程度，可以預測患者的死亡率〔1〕。維持足夠的肌肉數量和保持肌肉良好的性能，有助于維持老年患者的日?；顒硬⑶姨岣咂渖媛省１M管造成老年慢性病患者惡病質發生的原因還未明確，但氧化應激、炎癥、低氧、低營養狀態、心血管系統功能失調等因素已被證實與其有關。氧化應激是指體內氧化劑增多，導致氧化劑和抗氧化劑不平衡，研究發現其是導致老年COPD患者呼吸肌和肢體肌肉功能障礙的主要原因，也是癌癥、敗血癥、老年患者肌肉功能障礙發生的主要原因〔2〕。體內氧化劑的增高會改變蛋白質、DNA和脂質等分子的結構和功能，最終導致細胞的損傷和死亡。蛋白質氧化特別是蛋白質羰基化，會使酶活性、轉錄因子等發生變化，使蛋白質更易發生降解〔3〕。蛋白質羰基化貫穿于老年慢性病及其并發癥發生、發展的始終，在COPD，失用性肌肉萎縮，癌癥惡病質，敗血癥，生理老化等的動物模型中，已得到證實。本文將對蛋白質羰基化在生理、病理狀態下的發生機制及檢測方法做以綜述。

1 蛋白質羰基化的定義及檢測方法

蛋白質羰基化是蛋白質氧化的重要方式之一。其發生機制主要有：①Fenton和Haber-Weiss類型的金屬離子催化反應。金屬離子催化氧化劑與存在于蛋白質側鏈上的賴氨酸、精氨酸、脯氨酸和蘇氨酸之間形成羰基衍生物(醛類和酮)，這是機體內最重要的蛋白質氧化的機制。②另一機制是Michael加成反應〔4〕。此反應是在細胞膜上的多不飽和脂肪酸的過氧化反應期間，由賴氨酸、半胱氨酸或組氨酸的殘基與α、β不飽和醛反應生成的。③蛋白質與活性氧(ROS)直接反應也可能會形成含有高反應性羰基的蛋白質衍生物，或者形成含有高反應性羰基的肽片段。④另外，賴氨酸殘基與還原糖或其氧化產物(由糖基化反應或糖氧化反應生成)的二次反應也可能在蛋白質中產生活性羰基〔5〕。體內長期高水平的蛋白質羰基化會過度激活信號傳導通路，加速蛋白質的分解，最終導致細胞死亡。

目前蛋白質羰基化的檢測方法：通用的方法是酰肼檢測法，酰肼通過席夫醛的形式與蛋白質羰基發生特異性反應，并用氰基硼氫化鈉穩定〔6〕。生物素酰肼常用來標記和鑒定羰基化蛋白質，再通過無凝膠方法及親和素親和層析法，最后質譜分析進行直接檢測。另外可用穩定的同位素標記法鑒定蛋白質中的羰基，能克服非羰基化蛋白質中抗生物素蛋白(抗生物素蛋白的靜電性和疏水性的相互作用)影響實驗背景的問題。羰基化驗也是量化蛋白質氧化的一個準確、可靠的方法，羰基化驗能夠檢測到反應性羰基與2，4-二硝基苯肼發生化學反應后生成2，4-二硝基苯酚，使用了酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定，包括免疫印跡和免疫組織化學方法〔7〕。雖然羰基化驗會產生除了蛋白質羰基化以外的其他形式的氧化修飾，但其結果可靠、操作簡單方便使其在蛋白質氧化的檢測中具有較大的實用價值。

2 生理狀態下的骨骼肌細胞內蛋白質的羰基化

骨骼肌細胞內的氧化劑主要是超氧陰離子(O2-)和一氧化氮(NO)。正常情況下骨骼肌纖維收縮或者舒張時，則產生O2-或NO。在一氧化氮合酶作用下，NO與O2-反應生成活性氧(ROS)，觸發蛋白質的翻譯后修飾，是肌肉細胞產生力量的重要環節〔8〕。而骨骼肌細胞中的抗氧化劑主要包括存在于肌漿中的銅鋅超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和存在于線粒體基質內的錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶。另外，非酶抗氧化系統對抗氧化酶有補充作用，如存在于細胞膜上的脂溶性化合物維生素E，胡蘿卜素和泛醇等。ROS在信號通路的調控中可能起到關鍵作用，它能夠使肌肉更快地適應于收縮和舒張。ROS的產生量及產生時間決定了其對組織的影響程度。氧化劑在短時間內適度增加能夠激活信號傳導通路，使細胞盡快適應環境改變，同時免受壓力對肌纖維的進一步的影響〔9〕。然而當ROS過度增多或抗氧化劑合成減少會過度激活信號傳導通路，加速蛋白質的分解，最終導致細胞死亡〔10〕。

2.1衰老導致的蛋白質的羰基化 骨骼肌衰老被定義為隨著年齡的增長，肌肉性能的降低和健康指數的下降。衰老的有害影響在老年患者的骨骼肌和神經元等不可再生組織更容易被觀察到，因為其損傷或丟失的細胞不能被完整的有絲分裂細胞所替代。蛋白質羰基化是細胞衰老的原因之一。一項針對老年人的研究結果顯示：老年人股四頭肌中谷胱甘肽的氧化、脂質過氧化、Mn-SOD和過氧化氫酶活性、蛋白質羰基化、DNA氧化等化學反應都有不同程度的增加；其腹直肌中的Mn-SOD活性也顯示出更高的活性〔11〕。老年女性表現出更高水平的總蛋白羰基化和硝化及肋間肌中Mn-SOD含量增高，而老年男性只在四肢肌肉中表現出蛋白加成化合物的增加〔12〕。另外在一個衰老的動物模型研究發現，骨骼肌數量減少與生長激素、雌激素和雄激素生成減少，葡萄糖、脂肪酸、蛋白質代謝異常，氧化應激增加及體力活動減少等有關〔13〕。在一項嚙齒類動物研究中發現，衰老的膈肌細胞內氧化劑及抗氧化酶含量均會增高〔14〕。

2.2吸煙和蛋白質羰基化 研究發現吸煙人群骨骼肌的蛋白質羰基化水平顯著增加。老年長期吸煙者的股四頭肌中，糖酵解酶、肌酸激酶、碳酸酐酶-3、ATP-合酶和結構蛋白更容易被羰基化。老年吸煙者與老年非吸煙者相比較，老年長期吸煙者股四頭肌的功能顯著降低，這說明老年吸煙者肌肉中蛋白質羰基化可能在某種程度上與股四頭肌功能降低有關〔15〕。動物研究發現，長期接觸香煙煙霧的豚鼠肌肉中的糖酵解酶、肌酸激酶、碳酸依賴酶-3、ATP合成酶和結構蛋白更易羰基化。長期香煙煙霧暴露可能對暴露動物的所有肌肉產生直接的有害作用。無論動物呼吸系統中是否發現了組織結構的改變，香煙本身可能涉及的直接組織毒性(醛，過氧化物，氮氧化物和過氧化自由基等)都得到了強化。

3 病理狀態下蛋白質羰基化與骨骼肌功能障礙

3.1蛋白質羰基化與失用性肌萎縮 長期肌肉廢用可致肌肉數量顯著損失及肌肉功能的減退，例如在老年患者長期臥床休息的情況下，由于長期固定不動，身體不活動，導致肌肉量的減少和肌肉功能降低。固定肢體的老年動物模型表明肌肉量的減少和肌肉性能的降低是肌肉中蛋白質合成減少和蛋白水解速率增加的結果〔16〕。ROS水平增加可能與失用性肌肉萎縮的病理生理學相關。目前肌纖維中ROS的來源仍不明確，有幾個研究發現在骨骼肌萎縮過程中，黃嘌呤氧化酶和線粒體是誘導ROS產生的主要因素〔17〕。另外蛋白質羰基化通過激活骨骼肌中的鈣蛋白酶，半胱天冬酶-3和泛素-蛋白酶體等蛋白水解系統可能會促進蛋白質分解代謝來加速失用性肌肉萎縮〔10〕。

3.2蛋白質羰基化與老年COPD患者 老年COPD患者骨骼肌功能障礙的特點是肌力和耐力的降低。氧化應激是老年COPD患者(特別是重癥患者)的肌肉功能障礙的主要原因。有研究表明，老年COPD患者的血液、呼吸肌和四肢肌肉表現出高水平的脂質過氧化、谷胱甘肽的氧化、蛋白質的羰基化和硝化〔18〕。過多的ROS誘導減少蛋白質翻譯后的修飾和增加骨骼肌纖維內的關鍵酶和蛋白質的水解。老年COPD患者的局部和全身炎癥介質水平都是相對較低的，而在其骨骼肌和血液中，存在較高的氧化應激水平，其肌動蛋白、肌球蛋白重鏈等結構蛋白和肌酸激酶、碳酸酐酶-3等酶氧化水平增高〔19〕。另一項研究也發現，嚴重的老年COPD患者膈肌中蛋白氧化水平更高，并與呼吸肌的功能及氣道阻塞程度呈負相關〔20〕。有研究已經證實翻譯后的氧化修飾通常發生在對氧化敏感的蛋白質氨基酸殘基中，這可能導致蛋白質功能的喪失，或通過蛋白酶體加速蛋白質降解。

3.3蛋白質羰基化與癌癥惡病質 癌性惡病質被定義為體重減輕、肌肉萎縮、身體虛弱，并在沒有自愿減肥的情況下出現厭食癥，通常意味著預后不佳。老年惡病質患者全身肌肉均會受到氧化劑類似物的影響。在幾種癌癥惡病質的動物模型中，其氧化應激水平升高。在患有肝癌腹水的惡病質大鼠腓腸肌中，氧化應激標志物的水平，如總反應性羰基、蛋白加成化合物、蛋白酪氨酸硝化等顯著增高〔21〕。蛋白質羰基化誘導肌肉蛋白質降解，通過交叉反應機制，減少纖維長度，特別是快收縮肌纖維(Ⅱ型纖維)的長度，最終引發與癌癥和其他慢性病相關的惡病質的全身效應。機制可能與Ⅱ型纖維合成的過多的ROS，能誘導周圍蛋白質的氧化修飾，使其更易通過蛋白水解系統降解〔22〕。癌癥惡病質的發生打破了氧化還原的平衡，誘導參與肌肉結構和功能的關鍵蛋白氧化：例如參與糖酵解、ATP產生和分布、二氧化碳水化、肌肉收縮和線粒體代謝的蛋白質均被羰基化。

3.4蛋白質羰基化與膿毒血癥 膿毒血癥是指重癥感染的系統反應，臨床表現包括如發熱、心動過速、呼吸急促、白細胞增多和局部感染等。動物研究表明，患有膿毒血癥的大鼠膈肌中蛋白的羰基化和硝化水平是增加的，這表明內毒素血癥與呼吸肌力的減少息息相關〔23〕。在內毒素血癥大鼠的膈肌中，檢測發現醛縮酶A，甘油醛-3-磷酸脫氫酶和烯醇酶3β，肌酸激酶，碳酸酐酶-3，可收縮的α-肌動蛋白和線粒體泛醇-細胞色素C還原酶等糖酵解酶羰基化水平升高〔24〕。代謝和血流動力學因素、細菌內毒素、細胞因子、花生四烯酸代謝、一氧化氮和氧化應激等機制參與到膿毒血癥引起的呼吸肌功能障礙的發生。細胞分子如蘭尼堿受體，肌酸激酶和結構蛋白(肌動蛋白和肌球蛋白)的氧化被列為由膿毒血癥誘發的動物實驗模型肌肉收縮功能障礙最相關的指標之一。人類研究表明，在嚴重膿毒血癥患者的呼吸和肢體肌肉中同樣檢測到了蛋白質氧化和硝化水平的升高〔25〕。膿毒血癥患者的股外側肌蛋白質羰基化水平明顯高于對照組，而在呼吸肌肉(肋間外肌)內蛋白質羰基化水平沒有差異?？傊?，這些結果表明關鍵氨基酸的羰基化，特別是那些位于酶活性位點的氨基酸羰基化后，會干擾酶的活性。

綜上蛋白質羰基化能通過誘導關鍵蛋白質的修飾，改變細胞的結構和代謝，進一步改變肌肉的功能。更重要的是，羰基化的蛋白質可能更容易被骨骼肌纖維中的蛋白水解系統迅速降解，這是組織中蛋白質氧化的重要形式，會增加老年慢性病晚期患者惡病質的發生率。目前對這一領域的研究已經得到很大重視〔26〕。今后我們研究的方向可能涉及肌肉蛋白質羰基化程度與肌肉功能和數量的降低程度的相關性及對羰基化敏感的細胞內信號轉導通路的探討。為防止老年惡病質的發生和治療提供新的方法，為老年慢性病的治療提供新的思路。