腎衰飲對CRF大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路及炎癥狀態的影響

張亮 馬曉燕 王佳虹 遠方 馬賢德 席瑞

(1遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110032；2遼寧中醫藥大學附屬醫院；3沈陽藥科大學)

慢性腎衰竭(CRF)是可以由原發和繼發等多種原因引起的慢性腎臟疾病，導致腎單位逐漸失去功能，當健存的腎單位不足以排出體內代謝廢物和毒物時，就會導致內環境失衡，引起水、電解質和酸堿平衡紊亂〔1〕。本病病程遷延，治療周期長且易反復，西醫治療中出現諸多不良反應。已有諸多實驗和臨床研究表明傳統中醫藥對于治療CRF存在一定的優勢，可以改善患者的腎臟功能，延緩CRF的進展，延長進入腎臟替代治療的時間，并減少并發癥的發生。

CRF的發病機制比較復雜，有證據表明這一過程中細胞信號通路通過多個細胞因子介導腎纖維化起了重要作用〔2〕，共同參與CRF的發生和發展。現已發現參與腎臟間質纖維化的形成機制有炎癥、氧化應激反應、細胞凋亡、增殖等。其中腎臟慢性炎癥是CRF進展的重要機制，而toll樣受體(TLR)4在炎癥發生中發揮重要作用。有研究〔3〕發現在腎組織受損的過程中，死亡的腎臟細胞釋放自身細胞內的因子，刺激免疫細胞釋放促炎因子，引起TLR4/MyD88信號通路被激活，促使腎臟炎癥的發生，進一步證實了TLR4/髓樣細胞分化因子(MyD)88/核轉錄因子(NF)-κB信號通路的活化在CRF的發生發展過程中起重要作用。腎衰飲是馬曉燕教授長期應用于臨床治療腎衰病的常用方，并且經臨床實踐經驗〔4〕及實驗研究〔5〕證實該方藥治療CRF療效確切。本實驗從慢性炎癥角度，研究腎衰飲對信號通路TLR4/MyD88/NF-κB及其下游炎癥因子表達情況的影響，探討腎衰飲干預CRF的作用機制，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選取60只雄性SD大鼠，SPF級，6周齡，體重(180±20)g，在遼寧中醫藥大學實驗動物中心常規飼養。

1.1.2藥物與試劑 腎衰飲由黃芪、太子參、菟絲子、砂仁、白術、茯苓、法半夏、白茅根、藿香、佩蘭、鱉甲、丹參、莪術、水蛭、水紅花子、大黃等組成。藥材均購自遼寧省中醫院中草藥局；尿毒清顆粒(大黃、黃芪、白術、茯苓、白芍、丹參、車前草，15 g/袋，由廣州康臣藥業有限公司生產)；腺嘌呤(批號：1122B051，美國Amresco公司)；血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號分別：C013-2、C011-2)；水合氯醛(北京Solarbio有限公司，批號：T8590)； 多聚甲醛(北京 Solarbio有限公司，批號：P8430)；蘇木素-伊紅(HE)染色、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、TLR4、MyD88、NF-κB抗體(由博士德生物工程有限公司生產)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(由北京中杉金橋生物技術有限公司生產)。

1.1.3儀器與設備 酶標儀(thermo生產，MK3型)；電泳儀(上海天能科技有限公司生產，EPS300型)；數碼顯微鏡(德國徠卡公司生產，DM2000型)；凝膠成像分析系統(上海天能科技有限公司，SF4000型)。

1.2方法

1.2.1分組與造模 將60只大鼠隨機分為正常組和造模組(分別為12只、48只)，正常組予0.9%NaCl溶液8 ml/(kg·d)灌胃，造模組按照參考文獻里Yokozawa法〔6〕〔予腺嘌呤懸濁液200 mg/(kg·d)灌胃〕制作大鼠腎衰模型，均連續灌胃21 d。用10%水合氯醛水溶液3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，采集球后靜脈血1.5～2.0 ml，化驗血Scr、BUN水平。正常組取2只，造模組取6只，分別處死取腎臟組織進行HE染色，驗證造膜成功。將造模成功大鼠再隨機分為模型組13只、尿毒清組12只、腎衰飲組12只。

1.2.2實驗干預 腎衰飲組給予腎衰飲煎劑33.3 g/(kg·d)灌胃，每毫升藥液含生藥量為3.36 g；尿毒清組給予尿毒清顆粒以2.25 g/(kg·d)濃度溫水溶開后灌胃；模型組和正常組予0.9%Nacl溶液8 ml/(kg·d)灌胃，連續給藥4 w。

1.3樣本取材及檢測分析

1.3.1取材 各組大鼠連續給藥4 w后，測體重，予腹腔注射10%水合氯醛水溶液3.5 ml/kg以麻醉，剖腹，采集腹主動脈血液。隨機選取2只大鼠腎組織用于檢測病理變化；各組剩余大鼠腎臟組織中隨機選取6例，左側腎臟置于2 ml凍存管中，-80℃保存，用于Western印跡檢測；右側腎臟浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學法檢測。

1.3.2HE染色 取腎臟組織常規脫水后，浸蠟、包埋，制備4 μm切片，烤片2 h后，二甲苯脫蠟兩次，然后梯度乙醇水化，行HE染色，梯度乙醇及二甲苯透明，中性樹膠封片，數碼顯微鏡下觀察病理改變并拍照。

1.3.3檢測各組血清Scr、BUN水平 全自動生化分析儀檢測各組血清Scr、BUN水平。

1.3.4ELISA檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取各組血清樣本，自然融化，具體檢測方法按照ELISA試劑盒中附帶的說明書步驟進行。

1.3.5Western印跡法檢測腎臟組織內TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達 取各組凍存的腎臟組織，用手術刀切取100 mg腎臟組織，剪碎，置于2 ml離心管中，并加入1 ml含苯甲基磺酰氟-蛋白酶抑制劑(PMSF)的組織裂解液，高速勻漿機制備勻漿，冰面上裂解15 min，低溫高速離心機14 000 r/min離心15 min，測定蛋白濃度后，加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min變性。按照40 μg/孔的上樣量進行垂直電泳，濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉后，一抗(1∶400)孵育PVDF膜4℃過夜，二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，洗膜后，將PVDF膜置于凝膠成像分析系統中，并滴加電化學發光(ECL)工作液，采集圖像，并以凝膠成像分析系統中自帶軟件測定各目的蛋白條帶灰度值，并以目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值的比值作為該蛋白的相對表達水平，進行統計分析。

1.3.6免疫組織化學法檢測腎臟組織內TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達 取固定好的腎臟組織，流水下充分沖洗，常規脫水、浸蠟、包埋，制備5 μm厚石蠟切片，然后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，滴加3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉后，滴加一抗工作液(TLR4為1∶300；MyD88為1∶300；NF-κB為1∶200)4℃孵育過夜，次日洗片后，滴加即用型二抗工作液，37℃孵育1 h，DAB顯色10 min，蘇木素染色液復染，1%鹽酸乙醇分化后，中性樹膠封片，數碼顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，測定平均光密度值，以均數作為該例大鼠目的蛋白相對表達水平，進行統計分析。

1.3.7統計學分析 采用SPSS16.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1HE染色結果 正常組大鼠腎臟腎小球、腎小管、系膜結構正常，間質未見增寬，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠腎臟腎小球囊腔變大，血管球萎縮，成纖維細胞增多，小管的管壁薄厚不勻，系膜細胞增生，腎小管上皮細胞彌漫空泡變性，大部分腎小管擴張或者萎縮，基底膜增厚、斷裂，可見大量炎性細胞浸潤。腎衰飲組和尿毒清組大鼠腎臟系膜細胞增生減輕，成纖維細胞減少，腎小管上皮細胞空泡變性減輕，炎性細胞減少。見圖1。

2.2各組血清Scr、BUN水平 與正常組比較，模型組血清Scr、BUN水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，尿毒清組和腎衰飲組血清Scr、BUN水平均明顯降低(P<0.01)，尿毒清組和腎衰飲組比較無統計學差異。見表1。

2.3各組血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平 與正常組相比，模型組血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，尿毒清組和腎衰飲組血清IL-1β、IL-6、TNF-α表達水平均明顯降低(P<0.01)；與尿毒清組比較，腎衰飲組血清IL-6、TNF-α表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

圖1 各組腎臟組織病理形態(HE，×200)

表1 各組Scr、BUN水平及血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.4Western印跡法檢測各組腎臟組織內TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平 與正常組相比，模型組腎臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，尿毒清組和腎衰飲組大鼠腎臟組織中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平均明顯降低(P<0.01)，尿毒清組和腎衰飲組比較無統計學差異。見圖2、表2。

圖2 各組腎臟組織內TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達

2.5免疫組織化學法檢測各組腎臟組織內TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達情況 正常組腎臟組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達為陰性，模型組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白呈強陽性表達，尿毒清顆粒和腎衰飲干預后均能不同程度的減少TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(P<0.01)。見圖3～5、表3。

表2 各組大鼠腎臟組織內TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達水平比較

圖3 各組TLR4蛋白表達(DAB，×200)

圖4 各組MyD88蛋白表達(DAB，×200)

圖5 各組NF-κB蛋白表達(DAB，×200)

表3 各組腎臟組織內TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達比較

3 討 論

CRF與中醫文獻記載的“水腫”、“虛勞”、“關格”、“癃閉”、“溺毒”等疾病的病因和癥狀有一致和相似之處，主要病機特點為正虛邪實，正虛以脾腎虧虛為主，為發病之根本，邪實為內生毒邪，主要是濕、痰、毒、瘀互結，是疾病加重的主要原因。西醫認為CRF是各種慢性腎臟病持續進展的共同結局〔7〕。CRF可因腎組織在多種因素的影響下，單核-巨噬細胞系統被激活，巨噬細胞與腎臟固有細胞及細胞外基質相互作用，產生多種炎癥因子，使腎臟處于慢性炎癥狀態中，腎臟固有細胞被破壞，促進細胞外基質聚積。而CRF過程中氧化應激狀態被激活，導致炎癥細胞被大量激活、中性粒細胞炎性浸潤，產生大量促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α等〔8〕，進一步誘發炎癥反應。微炎癥和氧化應激反應被認為是腎功能惡化的重要機制〔9〕。現代醫學認為炎癥反應是CRF發生的始動因素。因此，抑制炎癥因子的表達，改善炎癥狀態，在一定程度上能夠延緩腎臟纖維化的進程，延緩CRF進展。本實驗采用以腺嘌呤懸液灌胃法制作CRF大鼠模型，其機制是游離的腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，當體內尿酸濃度足夠大時，其結晶主要沉積在腎小管和腎間質部位，引起腎小管阻塞及上皮細胞的萎縮或消失，周圍間質可見炎性細胞浸潤，肉芽腫形成且逐漸出現纖維化〔10〕。本文說明經尿毒清顆粒及腎衰飲干預后大鼠炎癥反應減輕，且腎衰飲的抗炎作用優于尿毒清顆粒。免疫和炎癥因子在腎臟疾病的發病機制中起重要作用〔11，12〕。天然免疫細胞，如巨噬細胞和樹突細胞，被認為在介導腎臟炎癥和損傷方面有重要作用〔12〕。先天免疫細胞通過識別病原體相關分子模式(PAMPs,識別外來病原體，并被刺激分泌促炎細胞因子和趨化因子〔12，13〕)和損傷相關分子模式(DAMPs,識別組織損傷產生的內源性配體)而發揮作用，其中DAMPs是腎臟先天免疫細胞活化和炎癥的重要誘因。TLRs表達在先天免疫細胞和腎臟固有細胞(如系膜和腎小管上皮細胞)上，并產生促炎細胞因子和趨化因子，導致腎損傷〔13，14〕。目前認為TLR2、TLR4、TLR9 被激活均可導致腎損傷。其中，TLR4被證明可表達于腎小管上皮細胞、內皮細胞等〔15，16〕。配體與TLR4結合，導致二聚和構象改變，從而導致下游信號級聯反應，下游信號的激活最終導致NF-κB進入細胞核并轉錄促炎癥靶基因，導致炎癥反應。此過程需要受體蛋白的募集，包括MyD88、含銜接蛋白的TIR結構域(TIRAP)、含銜接誘導干擾素的TIR結構域(TRIF)和TRIF相關銜接分子(TRAM)。現有研究〔17〕證明，主要有兩條TLR傳導途徑：①由MyD88銜接蛋白介導的MyD88信號通路; ②非依賴性MyD88信號通路。而依賴性MyD88途徑是TLR4的下游，該途徑導致促炎細胞因子的產生，并傳播到下游的NF-κB，導致轉錄因子的激活〔18〕。有研究表明糖尿病腎病的炎癥過程中先天免疫系統被激活〔19，20〕。導致糖尿病腎病腎臟不可逆性纖維化和器官衰竭的始動因素是炎癥〔21〕。在糖尿病患者的腎臟中信號通路NF-κB上調是已被認可的重要的糖尿病腎病的發病機制〔22〕。本文結果說明TLR4/MyD88/NF-κB信號通路處于過度活化狀態，并且參與慢性腎功能衰竭的發生發展過程，腎衰飲可以抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白的表達，并且作用與尿毒清顆粒等同。

脾腎虧虛與毒邪互結是CRF整個病變過程發生、發展的關鍵〔23〕。脾腎虧虛是本病發病的基礎，也是產生毒邪的根源，而毒邪亦是加重病情進展惡化及遷延不愈的重要外因。馬曉燕教授依據CRF的發病機制及病機演變過程，提出了“抗毒、解毒、排毒”三法相結合的治療思想，運用扶正與祛邪兼顧，健脾與補腎同治，重在健脾以抗毒，祛濕、化瘀以解毒，標本兼顧，臨證施治，總結出經驗方腎衰飲。腎衰飲以黃芪、太子參、菟絲子益氣健脾補腎；茯苓、白術、半夏、砂仁健運脾胃，調理升降，助腎命之氣以“抗毒”；白茅根、茯苓、藿香、佩蘭健脾祛濕排“濕毒”；鱉甲、丹參、莪術、水蛭、水紅花子活血化瘀以解“瘀毒”；大黃通腑瀉濁以“排毒”。本研究模型組大鼠升高的炎癥因子可被認為中醫的毒邪，即“濁毒”“瘀血”等。因此，腎衰飲“抗毒”“解毒”“排毒”的治法可以等同于改善CRF的炎癥狀態。在臨床上尿毒清顆粒主要治療慢性腎功能衰竭早、中期的患者，對中醫辨證屬脾虛濕濁癥或脾虛兼血瘀癥者療效明顯，諸多實驗和臨床研究均已證實其在治療慢性腎病的可行性。本研究證實腎衰飲在改善CRF大鼠腎臟功能方面作用與尿毒清顆粒是一致的，但在改善炎癥狀態方面腎衰飲優于尿毒清顆粒。