二氧化硫通過調控MMP-3/TIMP-1表達改善急性心肌梗死大鼠心肌纖維化

劉佳麗 張愛民 向長鐵 吳倩 聶連桂 劉茂軍 楊軍

(南華大學附屬第一醫院心內科，湖南 衡陽 421001)

急性心肌梗死(AMI)近年來在我國的患病率及死亡率均呈逐步增長趨勢〔1〕。盡管血運重建使許多患者存活，但AMI后患者仍可以發生負性心肌重構并可發展為心力衰竭，從而明顯影響疾病預后。AMI后心肌重構主要表現為心肌纖維化(MF)，其機制與心肌梗死后大量心肌細胞丟失，心肌成纖維細胞(CFs)增殖活化和細胞外基質蛋白(ECM)過度沉積有關〔2〕。基質金屬蛋白酶(MMPs)和MMPs抑制劑(TIMPs)兩者相互作用共同調控著ECM的動態平衡〔3〕，已發現MF發生機制與 MMPs/TIMPs失調有關。二氧化硫(SO2)作為新型的內源性氣體信號分子，有研究發現SO2具有通過抑制心肌細胞凋亡和內質網應激從而改善心臟功能〔4，5〕，但SO2能否改善AMI后的MF和心肌負性重構尚缺乏相關研究，本研究擬探討SO2可否通過調控MMP-3/TIMP-1蛋白的表達改善異丙腎上腺素(Iso)誘導的AMI大鼠的MF。

1 材料與方法

1.1實驗動物 取健康雄性成年SD大鼠40只，體重(250±20)g，購于南華大學動物實驗中心，飼養于恒溫(22±2)℃恒濕環境中，晝夜交替各12 h，能自由獲得水和飼料。

1.2實驗試劑 Iso購于中國大連美侖生物公司，亞硫酸鈉(Na2SO3)和亞硫酸氫鈉(NaHSO3)購于美國Sigma公司，兔一抗MMP13、TIMP1、GAPDH及羊抗兔二抗購于美國 Proteintech公司，BCA蛋白定量試劑盒及細胞裂解液由中國碧云天生物公司提供，Masson染色試劑盒由中國邁新生物技術開發公司提供。

1.3動物模型的建立及分組 首先，在上述環境中將40只SD大鼠適應性喂養1 w后，然后隨機分成正常對照(Control)組、模型(Iso)組、SO2干預(Iso+SO2)組、SO2對照(SO2)組，每組各10只。按文獻建立AMI大鼠模型，以Iso 50 mg/(kg·d)腹腔注射持續2 d，Control組及SO2組大鼠則腹腔注射等量生理鹽水，行心電圖及血漿肌鈣蛋白檢測確定造模成功后，Iso+SO2組和SO2組大鼠腹腔注射Na2SO3/NaHSO3溶液(0.54±0.18) mmol/(kg·d)共4 w〔4〕，Control組及Iso組大鼠則腹腔注射等量生理鹽水共4 w。

1.4組織提取 持續4 w后，腹腔注射10%的水合氯醛將大鼠麻醉，開胸后剪取心臟并保留左室及室間隔，用4%的多聚甲醛固定適量心肌組織備用Masson染色，-80℃冰箱凍存剩余心肌組織備用Western印跡檢測。

1.5Masson染色 每組均將適量心肌組織用甲醛固定的，依次將石蠟包埋切片、脫蠟至水，取Weigert鐵蘇木素染5 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，流水沖洗數分鐘返藍，麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水快速漂洗，磷鉬酸水溶液處理約3～5 min，苯胺藍夜復染5 min，1%的冰醋酸分化處理1 min，無水乙醇脫水后二甲苯透明并予以中性樹膠封固，光鏡下觀察各組心肌組織膠原沉積情況。

1.6Western印跡檢測蛋白表達 每組均稱量適量新鮮的左心室心肌組織，剪碎后加入細胞裂解液及苯甲基磺酰氟(PMSF)，然后放置于冰上，進行多次充分研磨，裂解30 min分鐘后提取上清液，測定蛋白濃度，進行電泳，予以配膠、上樣、轉膜、封閉、孵育一抗(GAPDH、MMP-3、TIMP-1)4℃過夜、TBST漂洗3次(10 min)、孵育二抗(羊抗兔)1 h(37℃)，顯色。AlphaImagar軟件進行灰度掃描，然后進行統計分析，將數據導入Origin8軟件進行制圖。

1.7統計方法 運用SPSS18.0軟件進行方差齊性檢驗、t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1大鼠存活情況 4 w后，39只大鼠存活，其中Control組10只，Iso組9只，Iso+SO2組10只，SO2組10只。

2.2各組心電圖檢測結果 與Control組相比，Iso組及Iso+SO2組心電圖Ⅱ導聯ST段明顯抬高，Control 組和SO2組心電圖無明顯改變，提示Iso組及Iso+SO2組AMI模型建立成功。見圖1。

2.3各組血漿肌鈣蛋白T檢測結果 與Control 組〔(34.445±5.246)pg/ml〕相比，Iso組〔(323.312±77.525)pg/ml〕及Iso+SO2組〔(316.755±58.615)pg/ml〕血漿肌鈣蛋白T水平顯著升高，Control 組和SO2組〔(34.531±4.716)pg/ml〕比較肌鈣蛋白無明顯改變，提示Iso組及Iso+SO2組AMI模型建立成功。

2.4各組Masson染色結果 Iso組大鼠心肌組織間的膠原纖維沉積較Control 組明顯增多。Iso+SO2組大鼠心肌組織組織間膠原纖維沉積較Iso組明顯較少。而SO2組與Control 組相比，大鼠心肌組織間的膠原纖維沉積未見明顯差異。見圖2。

2.5各組心肌組織中MMP-3、TIMP-1蛋白表達水平 與Control 組相比，Iso組心肌中MMP-3蛋白表達顯著上調(P<0.05)，TIMP-1蛋白表達顯著下調(P<0.05)，與Iso組相比，SO2+Iso組心肌中MMP-3蛋白表達顯著下調(P<0.05)，TIMP-1蛋白表達顯著上調(P<0.05)，而Control 組與SO2組相比，以上蛋白表達無顯著差異(P>0.05)。見表1、圖3。

A：Control組、B：Iso組、C：Iso+SO2組、D：SO2組；圖2同圖1 各組心電圖

圖2 各組心肌組織Masson染色(×400)

表1 各組MMP-3、TIMP-1蛋白表達水平比較

圖3 各組心肌組織中MMP-3、TIMP-1蛋白表達

3 討 論

Iso作為β受體激動劑，當大劑量作用于心臟時，將導致冠狀動脈嚴重痙攣，進而導致心肌缺血缺氧，并誘發AMI，目前大劑量的Iso誘導已成為AMI大鼠常用的造模方法〔6，7〕。當AMI死后血運未及時得到重建，心肌細胞可由于缺血缺氧而發生大量壞死，進而導致心肌重構，而心肌重構主要表現為MF，MF可導致舒張功能障礙和心律失常，最終導致心力衰竭，本研究中Iso組大鼠在AMI后出現了明顯MF，及時將AMI患者進行血運重建以及抑制MF直接關系到患者的預后及轉歸。

MMPs為一組鋅離子依耐性內肽酶，可以特異性降解ECM，TIMPs是MMPs內源性抑制劑〔8〕，MMPs和TIMPs兩者相互作用共同調控著體內ECM的動態平衡并參與了人體多個臟器纖維化過程〔9，10〕。MF主要表現為ECM在心肌間質異常沉積，急性心肌損傷后，各種炎癥細胞因子和促纖維化因子增加，同時產生MMPs和TIMPs〔11〕，故調控MMPs及TIMPs的動態平衡在防治MF過程中發揮著重要作用，有研究發現MF的發展依賴于MMPs的上調及TIMPs的下調〔12〕。MMPs可根據底物、一級結構不同分為膠原酶、間質溶解素、明膠酶、彈性蛋白酶〔13〕，MMP-3是MMPs家族的一份子，為間質溶解素，MMP-11與MMP-3同屬于間質溶解素，已有學者發現在高甲狀腺誘導的MF過程中MMP-11明顯上調〔14〕。TIMP-1是TIMPs家族按作用靶點不同分出的重要成員之一，其功能主要是抑制MMPs的活性，研究發現通過上調TIMP-1的表達可改善異丙腎上腺素誘導的心肌纖維化〔12〕。本研究提示MMP-3和TIMP-1在AMI MF過程中可能發揮著重要作用。

內源性氣體信號分子SO2是近年來新發現具有多種生物學效應的氣體信號分子，其主要產生于含硫氨酸代謝中，同屬于含硫氨酸代謝產物硫化氫、牛磺酸、同型半胱氨酸均已被證實在心血管功能調節中發揮著重要的生物學作用〔15〕，而SO2已發現具有調節心功能、舒張血管、保護心肌缺血再灌注損傷、改善高血壓及肺動脈高壓的作用〔16〕。有研究發現，SO2具有通過抑制細胞凋亡降低Iso所致的心肌細胞損傷〔4〕；也有學者發現，SO2可抑制細胞凋亡和內質網應激從而改善糖尿病大鼠心肌纖維化〔5〕。本實驗發現SO2可改善AMI大鼠的MF。綜上所述，SO2可能通過下調MMP-3蛋白表達和上調TIMP-1蛋白表達進而改善AMI大鼠后的MF，但其中更多內在調控機制仍需進一步研究。