二氧化硫通過調(diào)控MMP-3/TIMP-1表達改善急性心肌梗死大鼠心肌纖維化

劉佳麗 張愛民 向長鐵 吳倩 聶連桂 劉茂軍 楊軍

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 衡陽 421001)

急性心肌梗死(AMI)近年來在我國的患病率及死亡率均呈逐步增長趨勢〔1〕。盡管血運重建使許多患者存活，但AMI后患者仍可以發(fā)生負性心肌重構(gòu)并可發(fā)展為心力衰竭，從而明顯影響疾病預(yù)后。AMI后心肌重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌纖維化(MF)，其機制與心肌梗死后大量心肌細胞丟失，心肌成纖維細胞(CFs)增殖活化和細胞外基質(zhì)蛋白(ECM)過度沉積有關(guān)〔2〕。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和MMPs抑制劑(TIMPs)兩者相互作用共同調(diào)控著ECM的動態(tài)平衡〔3〕，已發(fā)現(xiàn)MF發(fā)生機制與 MMPs/TIMPs失調(diào)有關(guān)。二氧化硫(SO2)作為新型的內(nèi)源性氣體信號分子，有研究發(fā)現(xiàn)SO2具有通過抑制心肌細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而改善心臟功能〔4，5〕，但SO2能否改善AMI后的MF和心肌負性重構(gòu)尚缺乏相關(guān)研究，本研究擬探討SO2可否通過調(diào)控MMP-3/TIMP-1蛋白的表達改善異丙腎上腺素(Iso)誘導(dǎo)的AMI大鼠的MF。

1 材料與方法

1.1實驗動物 取健康雄性成年SD大鼠40只，體重(250±20)g，購于南華大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于恒溫(22±2)℃恒濕環(huán)境中，晝夜交替各12 h，能自由獲得水和飼料。

1.2實驗試劑 Iso購于中國大連美侖生物公司，亞硫酸鈉(Na2SO3)和亞硫酸氫鈉(NaHSO3)購于美國Sigma公司，兔一抗MMP13、TIMP1、GAPDH及羊抗兔二抗購于美國 Proteintech公司，BCA蛋白定量試劑盒及細胞裂解液由中國碧云天生物公司提供，Masson染色試劑盒由中國邁新生物技術(shù)開發(fā)公司提供。

1.3動物模型的建立及分組 首先，在上述環(huán)境中將40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，然后隨機分成正常對照(Control)組、模型(Iso)組、SO2干預(yù)(Iso+SO2)組、SO2對照(SO2)組，每組各10只。按文獻建立AMI大鼠模型，以Iso 50 mg/(kg·d)腹腔注射持續(xù)2 d，Control組及SO2組大鼠則腹腔注射等量生理鹽水，行心電圖及血漿肌鈣蛋白檢測確定造模成功后，Iso+SO2組和SO2組大鼠腹腔注射Na2SO3/NaHSO3溶液(0.54±0.18) mmol/(kg·d)共4 w〔4〕，Control組及Iso組大鼠則腹腔注射等量生理鹽水共4 w。

1.4組織提取 持續(xù)4 w后，腹腔注射10%的水合氯醛將大鼠麻醉，開胸后剪取心臟并保留左室及室間隔，用4%的多聚甲醛固定適量心肌組織備用Masson染色，-80℃冰箱凍存剩余心肌組織備用Western印跡檢測。

1.5Masson染色 每組均將適量心肌組織用甲醛固定的，依次將石蠟包埋切片、脫蠟至水，取Weigert鐵蘇木素染5 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，流水沖洗數(shù)分鐘返藍，麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水快速漂洗，磷鉬酸水溶液處理約3～5 min，苯胺藍夜復(fù)染5 min，1%的冰醋酸分化處理1 min，無水乙醇脫水后二甲苯透明并予以中性樹膠封固，光鏡下觀察各組心肌組織膠原沉積情況。

1.6Western印跡檢測蛋白表達 每組均稱量適量新鮮的左心室心肌組織，剪碎后加入細胞裂解液及苯甲基磺酰氟(PMSF)，然后放置于冰上，進行多次充分研磨，裂解30 min分鐘后提取上清液，測定蛋白濃度，進行電泳，予以配膠、上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(GAPDH、MMP-3、TIMP-1)4℃過夜、TBST漂洗3次(10 min)、孵育二抗(羊抗兔)1 h(37℃)，顯色。AlphaImagar軟件進行灰度掃描，然后進行統(tǒng)計分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin8軟件進行制圖。

1.7統(tǒng)計方法 運用SPSS18.0軟件進行方差齊性檢驗、t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠存活情況 4 w后，39只大鼠存活，其中Control組10只，Iso組9只，Iso+SO2組10只，SO2組10只。

2.2各組心電圖檢測結(jié)果 與Control組相比，Iso組及Iso+SO2組心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段明顯抬高，Control 組和SO2組心電圖無明顯改變，提示Iso組及Iso+SO2組AMI模型建立成功。見圖1。

2.3各組血漿肌鈣蛋白T檢測結(jié)果 與Control 組〔(34.445±5.246)pg/ml〕相比，Iso組〔(323.312±77.525)pg/ml〕及Iso+SO2組〔(316.755±58.615)pg/ml〕血漿肌鈣蛋白T水平顯著升高，Control 組和SO2組〔(34.531±4.716)pg/ml〕比較肌鈣蛋白無明顯改變，提示Iso組及Iso+SO2組AMI模型建立成功。

2.4各組Masson染色結(jié)果 Iso組大鼠心肌組織間的膠原纖維沉積較Control 組明顯增多。Iso+SO2組大鼠心肌組織組織間膠原纖維沉積較Iso組明顯較少。而SO2組與Control 組相比，大鼠心肌組織間的膠原纖維沉積未見明顯差異。見圖2。

2.5各組心肌組織中MMP-3、TIMP-1蛋白表達水平 與Control 組相比，Iso組心肌中MMP-3蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)，TIMP-1蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)，與Iso組相比，SO2+Iso組心肌中MMP-3蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)，TIMP-1蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05)，而Control 組與SO2組相比，以上蛋白表達無顯著差異(P>0.05)。見表1、圖3。

A：Control組、B：Iso組、C：Iso+SO2組、D：SO2組；圖2同圖1 各組心電圖

圖2 各組心肌組織Masson染色(×400)

表1 各組MMP-3、TIMP-1蛋白表達水平比較

圖3 各組心肌組織中MMP-3、TIMP-1蛋白表達

3 討 論

Iso作為β受體激動劑，當大劑量作用于心臟時，將導(dǎo)致冠狀動脈嚴重痙攣，進而導(dǎo)致心肌缺血缺氧，并誘發(fā)AMI，目前大劑量的Iso誘導(dǎo)已成為AMI大鼠常用的造模方法〔6，7〕。當AMI死后血運未及時得到重建，心肌細胞可由于缺血缺氧而發(fā)生大量壞死，進而導(dǎo)致心肌重構(gòu)，而心肌重構(gòu)主要表現(xiàn)為MF，MF可導(dǎo)致舒張功能障礙和心律失常，最終導(dǎo)致心力衰竭，本研究中Iso組大鼠在AMI后出現(xiàn)了明顯MF，及時將AMI患者進行血運重建以及抑制MF直接關(guān)系到患者的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。

MMPs為一組鋅離子依耐性內(nèi)肽酶，可以特異性降解ECM，TIMPs是MMPs內(nèi)源性抑制劑〔8〕，MMPs和TIMPs兩者相互作用共同調(diào)控著體內(nèi)ECM的動態(tài)平衡并參與了人體多個臟器纖維化過程〔9，10〕。MF主要表現(xiàn)為ECM在心肌間質(zhì)異常沉積，急性心肌損傷后，各種炎癥細胞因子和促纖維化因子增加，同時產(chǎn)生MMPs和TIMPs〔11〕，故調(diào)控MMPs及TIMPs的動態(tài)平衡在防治MF過程中發(fā)揮著重要作用，有研究發(fā)現(xiàn)MF的發(fā)展依賴于MMPs的上調(diào)及TIMPs的下調(diào)〔12〕。MMPs可根據(jù)底物、一級結(jié)構(gòu)不同分為膠原酶、間質(zhì)溶解素、明膠酶、彈性蛋白酶〔13〕，MMP-3是MMPs家族的一份子，為間質(zhì)溶解素，MMP-11與MMP-3同屬于間質(zhì)溶解素，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在高甲狀腺誘導(dǎo)的MF過程中MMP-11明顯上調(diào)〔14〕。TIMP-1是TIMPs家族按作用靶點不同分出的重要成員之一，其功能主要是抑制MMPs的活性，研究發(fā)現(xiàn)通過上調(diào)TIMP-1的表達可改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心肌纖維化〔12〕。本研究提示MMP-3和TIMP-1在AMI MF過程中可能發(fā)揮著重要作用。

內(nèi)源性氣體信號分子SO2是近年來新發(fā)現(xiàn)具有多種生物學(xué)效應(yīng)的氣體信號分子，其主要產(chǎn)生于含硫氨酸代謝中，同屬于含硫氨酸代謝產(chǎn)物硫化氫、牛磺酸、同型半胱氨酸均已被證實在心血管功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用〔15〕，而SO2已發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)心功能、舒張血管、保護心肌缺血再灌注損傷、改善高血壓及肺動脈高壓的作用〔16〕。有研究發(fā)現(xiàn)，SO2具有通過抑制細胞凋亡降低Iso所致的心肌細胞損傷〔4〕；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，SO2可抑制細胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而改善糖尿病大鼠心肌纖維化〔5〕。本實驗發(fā)現(xiàn)SO2可改善AMI大鼠的MF。綜上所述，SO2可能通過下調(diào)MMP-3蛋白表達和上調(diào)TIMP-1蛋白表達進而改善AMI大鼠后的MF，但其中更多內(nèi)在調(diào)控機制仍需進一步研究。