SIRT3基因在老年膀胱癌組織中表達及對上皮間質轉化的影響

蔡波 邢錢偉 管楊波 吳優 郭新

(南通大學附屬醫院泌尿外科，江蘇 南通 226001)

膀胱癌是一類病因多且復雜、發病率較高的泌尿系統惡性腫瘤，大部分膀胱癌患者最初明確診斷時多為分化良好或中等分化的表淺性膀胱尿路上皮癌，采取手術治療預后較好〔1〕。但由于膀胱尿路上皮癌細胞增殖和浸潤易發生浸潤性或轉移性膀胱癌，給臨床治療帶來巨大挑戰，特別是老年患者由于上皮細胞分化低下而5年生存率更低〔2〕。腫瘤增殖、侵襲和轉移能力涉及多種作用機制，研究已證實上皮間質轉化(EMT)是該生物學行為中胚胎發育關鍵程序〔3〕。E-鈣黏素(E-cadherin)缺失被認為是EMT發生一個重要標志，而Snail、Slug為E-cadherin主要抑制因子，可通過下調E-cadherin表達而誘導EMT發生和腫瘤生物學行為改變。沉默信息調節因子家族(Sirtuins)可調控衰老和腫瘤發生和發展，其中以SIRT3基因變化最為敏感。研究顯示，結直腸癌細胞中SIRT3表達顯著低于癌旁正常組織，且低表達組總生存期(OS)、無進展生存時間(PFS)縮短〔4〕。而另有研究表明肝癌、成纖維細胞腫瘤中SIRT3表達較低，且敲除SIRT3后可顯著抑制腫瘤發生和發展〔5〕。參閱國內外報道和文獻，SIRT3在膀胱癌中的表達及其影響機制尚存在爭議。因此本研究從分子水平上探討老年膀胱癌組織中SIRT3的表達及其與EMT的關系。

1 材料與方法

1.1臨床材料與組織標本 經病理檔案室收集2016年6月至2019年6月南通大學附屬醫院行手術切除的膀胱癌組織標本及配對癌旁正常組織108例，獲取術中組織液氮冷凍后放入-80℃保存，記錄圍術期臨床資料。納入標準：①參照相關診斷共識〔6〕，由主任醫師根據病灶處黏膜組織活檢術確診為膀胱癌；②參照TNM分期系統進行腫瘤分期；③年齡65～85歲；④首次確診，既往未進行過放化療；⑤不合并其他惡性腫瘤；⑥入院前半個月無嚴重急性感染病史。排除標準：①合并心、肝、腎等嚴重內外科疾病者；②標本保存不正確；③依從性特別差或中途要求退出的受試者；④臨床資料不完整，相關檢查不完善。男77例、女31例，年齡65～79歲，中位年齡75歲，<75歲47例、≥75歲61例，體重指數(BMI)<18.5 kg/m250例、≥18.5 kg/m258例，腫瘤直徑≤5 cm 62例、>5 cm 46例，Ⅰ～Ⅱ期49例、Ⅲ～Ⅳ期59例，有淋巴結轉移47例、無淋巴結轉移61例，低分化56例、高中分化52例。

1.2細胞株與重組慢病毒轉染細胞 30株人膀胱癌UMUC3-141細胞購自上海北諾生物科技有限公司，研究獲得醫學倫理會批準，實驗符合癌細胞處理和使用相關規定。進行原代培養，取其對數生長期的細胞，接種于6孔細胞培養板中(5×104個/孔)；用含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，細胞貼壁后換液；待細胞融合度達到70%～80%，換無血清的培養基同步化24 h，按照Lipofectamine 2000轉染說明書進行轉染；將人膀胱癌UMUC3-141細胞分為空白組(不作任何處理)、對照組(轉染空白SIRT3質粒pGenesil2-Sirt3-shRNA)、SIRT3組(轉染SIRT3質粒pcDNA3.1-Sirt3)各10株：轉染72 h后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效果，綠色熒光細胞所占百分比>80%表示轉染成功可進行后續實驗。

1.3實驗試劑和儀器 試劑：總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，反轉錄試劑盒(美國Takara公司)，RIPA蛋白裂解液(四川訊麥科技有限公司)，10%胎牛血清(吉泰生物有限公司)，DMEM培養液(廣州威佳科技有限公司)，BCA試劑盒(泉州睿信生物科技有限公司)，ECL發光試劑盒(北京沃比森科技有限公司)，Lipofectamine 2000轉染說明書(上海恒斐生物科技有限公司)，空白SIRT3質粒pGenesil2-Sirt3-shRNA、SIRT3質粒pcDNA3.1-Sirt3(上海欽誠生物技術服務有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，杭州百思生物科技有限公司)，CCK-8溶液(長海李記生物科技有限公司)，Transwell小室(上海夏夷實業有限公司)，基質膠(北京生東科技有限公司)，4%多聚甲醛溶液(廣州翔博生物科技有限公司)，蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(蘇州澤科生物科技有限公司)，胰蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司)，無血清培養基(北京奧博星生物技術有限責任公司)。儀器：DMi8倒置熒光顯微鏡(德國徠卡顯微系統有限公司)、WJ-3-160T型CO2培養箱(上海新諾儀器設備有限公司)、實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)、MR-100酶標儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.4方法

1.4.1免疫組化染色法 取癌細胞和癌旁細胞石蠟塊，連續厚度為4 μm的切片，烤片4～5 h后脫蠟處理；將切片放入加熱沸騰的含抗原修復液高壓鍋中進行高溫修復，冷卻后PBS沖洗3次；滴加3% H2O2100 μl，置入37℃孵育箱20 min，PBS沖洗3次；滴加10%山羊血清100 μl，室溫孵育15～20 min；每張切片組織上快速均勻滴加一抗各100 μl，置于 37℃孵育箱1 h，PBS沖洗3次；孵育二抗，各滴加二抗100 μl，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，顯色好的切片反復沖洗，直至鏡下觀察細胞核變藍；參考相關文獻〔7〕計算陽性表達情況。

1.4.2Western印跡法 取癌細胞和癌旁細胞石蠟塊，加蛋白裂解液、勻漿、離心，使用BCA試劑盒測定蛋白質濃度；取總蛋白上樣，電泳、切膠、轉膜、TBST封閉；加入SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶2 000)，4℃冰箱過夜；TBST緩沖液漂洗，加山羊抗兔二抗抗，25℃搖床1 h；洗膜，使用ECL發光試劑盒曝光、顯影；以GAPDH為內參蛋白，分析各條條帶的灰度值(ECL發光試劑盒對PVDF膜進行曝光顯影)，成像掃描分析系統測定內參和目的條帶的灰度值。

1.4.3CCK8細胞增殖實驗 傳代培養3組UMUC3-141細胞，取生長狀態良好的對數生長期細胞制成單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中(2×103個/孔)；待細胞貼壁后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，于5%CO2、37℃的培養箱中培養180 min；AMR-100酶標儀測定12 h、24 h、36 h、48 h時450 nm波長處的光密度(OD)值，細胞增殖率= (研究組細胞OD/空白組細胞OD)×100%。

1.4.4Transwell小室實驗 調整3組UMUC3-141細胞濃度至5×108/L，于Transwell小室上室中加入60 μl基質膠，下室中加600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養液，于5%CO2、37℃培養箱中培養24 h；棄上室液體，4%多聚甲醛溶液固定15 min，HE染色試劑盒染色30 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察并計算穿過小室膜的平均細胞數，以此表示細胞侵襲能力。

1.4.5劃痕實驗 取3組UMUC3-141細胞，0.25%胰蛋白酶消化，吹打至細胞懸液，調整細胞濃度至2×108/L；接種于48孔板中，待細胞融合度達80%，用槍頭沿著與皿底垂直方向劃痕；PBS洗滌3次，加入無血清培養基，于5%CO2、37℃的培養箱中培養24 h，觀察細胞遷移軌跡。

1.4.6Western印跡檢測EMT調控因子表達量 取3組細胞，參照“1.4.2”進行Western印跡法檢測，獲得3組E-cadherin、Snail、Slug與β-actin的灰度值比值。

1.4.7免疫熒光法觀察癌細胞形態變化 取3組細胞，沖洗、固定、風干，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；次日用PBST浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20～37℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBST 5 min、4次洗去多余DAPI；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，獲得熒光顯微鏡下癌細胞形態圖像。

1.5觀察指標 ①膀胱癌組織和癌旁正常組織中SIRT3及EMT標志基因E-cadherin、Snail、Slug表達水平，分析SIRT3與E-cadherin、Snail、Slug相關性；②膀胱癌組織和癌旁正常組織中SIRT3及EMT標志基因E-cadherin陽性表達率；③SIRT3表達與膀胱癌患者臨床病理特征關系；④空白組(不作任何處理)、對照組(轉染空白SIRT3質粒pGenesil2-Sirt3-shRNA)、SIRT3組(轉染SIRT3質粒pcD-NA3-1-Sirt3)3組癌細胞增殖、侵襲、轉移能力及E-cadherin、Snail、Slug表達量。

1.6統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗、相關性分析。

2 結 果

2.1不同組織的陽性率比較 SIRT3主要定位于膀胱癌細胞核或胞質中，呈藍色顆粒，在膀胱癌中陰性表達；E-cadherin、Snail、Slug主要定位于細胞膜中，E-cadherin呈藍色顆粒，Snail、Slug呈棕黃色顆粒。膀胱癌組織中SIRT3、E-cadherin表達明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)，Snail、Slug明顯高于癌旁正常組織(P<0.05),見圖1，表1。

圖1 SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug表達(DAB，×100)

表1 不同組織的陽性率對比

2.2不同組織蛋白相對表達量比較 膀胱癌組織中SIRT3、E-cadherin表達量明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)，Snail、Slug表達量明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，見圖2,表2。

2.3SIRT3與E-cadherin、Snail、Slug相關性 SIRT3與E-cadherin呈正相關(r=0.232,P=0.022),與Snail、Slug呈負相關(r=-0.553,P<0.001;r=-0.248,P=0.014)。

2.4SIRT3與膀胱癌患者臨床病理特征的關系分析 性別、BMI、分化程度不同的膀胱癌患者，癌組織中SIRT3陽性表達率差異無統計學意義(P>0.05)；年齡≥75歲、腫瘤直徑>5 cm、腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的膀胱癌患者SIRT3陽性表達率明顯低于年齡<75歲、腫瘤直徑≤5 cm、腫瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移的膀胱癌患者SIRT3陽性表達率(P<0.05)，見表3。

圖2 SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug蛋白表達(Western印跡)

表2 不同組織蛋白相對表達量對比

表3 SIRT3陽性表達與膀胱癌患者臨床病理特征的關系〔n(%)〕

2.53組UMUC3-141細胞增殖率分析 轉染SIRT3后，UMUC3-141細胞增殖受到抑制；24 h、36 h、48 h時，SIRT3組UMUC3-141細胞增殖率明顯低于對照組、空白組(P<0.05)，空白組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)。SIRT3組UMUC3-141細胞增殖率隨時間延長增殖率下降速度更顯著(P<0.05)，見表4。

2.63組UMUC3-141細胞侵襲能力 空白組、對照組UMUC3-141細胞向器官表面靠攏，基底層可見較多偽足，形成的癌巢較大；SIRT3組UMUC3-141細胞較少，不見偽足或僅有少量偽足，未形成癌巢。見圖3。轉染SIRT3后，UMUC3-141細胞侵襲能力受到抑制；SIRT3組UMUC3-141細胞數(28.69±3.50)明顯低于對照組(78.21±15.83)、空白組(75.05±16.04，P<0.05)，空白組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.73組UMUC3-141細胞轉移能力分析 空白組、SIRT3組UMUC3-141細胞在劃痕48 h后逐漸愈合、劃痕變小，SIRT3組UMUC3-141細胞在劃痕48 h后未發生愈合、劃痕甚至變大。見圖4。轉染SIRT3后，SIRT3組UMUC3-141細胞轉移率(10.23±3.55)明顯低于對照組(82.31±9.62)、空白組(83.68±9.35，P<0.05)，空白組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.8SATB1過表達誘導膀胱癌細胞EMT發生 免疫熒光結果顯示，空白組和對照組UMUC3-141細胞為卵圓形，轉染SATB1后UMUC3-141細胞為長紡錘狀、呈典型EMT形態學改變，見圖5。

表4 3組轉染后不同時間點UMUC3-141細胞增殖率比較

圖3 3組UMUC3-141細胞侵襲能力(HE，×400)

圖4 3組UMUC3-141細胞遷移能力(HE，×400)

圖5 UMUC3-141細胞形態(DAPI染色，×400)

2.93組UMUC3-141標志基因蛋白組對表達量比較 轉染SIRT3后，SIRT3組EMT標志基因蛋白E-cadherin升高而Snail、Slug表達下降；且SIRT3組E-cadherin明顯高于對照組、空白組而Snail、Slug明顯低于對照組、空白組(P<0.05)，空白組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)，見表5，圖6。

表5 三組UMUC3-141標志基因蛋白相對表達量比較

圖6 轉染SIRT3后各組SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug表達(Western印跡)

3 討 論

SIRT3基因自發現以來已被證實可參與多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移過程：孫軍等〔8〕研究顯示在非小細胞肺癌組織中SIRT3呈低表達，且低表達SIRT3組侵襲能力更高；李攬亞等〔9〕指出高表達SIRT3可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移過程；Ma等〔10〕的體外實驗結果顯示，SIRT3在腎癌細胞中低表達，上調SIRT3表達可抑制癌細胞血管浸潤和淋巴結轉移，且預示著該病預后較好。本研究結果說明SIRT3下調可促進尿路上皮腫瘤發生。此時膀胱癌組織中EMT標志基因E-cadherin下降而Snail、Slug升高，Snail、Slug因子為上皮細胞標志性蛋白E-cadherin直接轉錄抑制因子，考慮EMT發生與SIRT3相關。相關性結果顯示SIRT3與E-cadherin呈正相關而與Snail、Slug呈負相關，考慮SIRT3下調可誘導EMT發生，進而促進膀胱癌侵襲轉移。

基于EMT發生途徑，多項研究證實EMT為多種腫瘤原位侵襲和轉移基礎〔11，12〕。王路明等〔13〕發現補骨脂盼通過抑制 SIRT3通路,促進ROS產生,誘導細胞凋亡,抑制細胞增殖和遷移,從而發揮抗口腔鱗狀細胞癌作用。Li等〔14〕指出SIRT3可通過磷酸甲基化參與蛋白質轉錄、翻譯過程，進而調控基因組織。SATBI可與尿路上皮膜上E-cadherin蛋白結合而發揮維持細胞間黏附狀態作用。當機體被病毒、毒素等刺激時，SIRT3蛋白可大量缺失而抑制E-cadherin分泌，導致E-cadherin下調而其抑制因子Snail、Slug進一步高表達，加快EMT發生，進而促進癌細胞進展。相關研究證實了SIRT3蛋白和EMT通路之間的關系，提出SIRT3表達可抑制膀胱組織及腎組織上皮細胞EMT通路傳導和轉錄〔15，16〕。本研究結果提示過表達SIRT3對促進癌細胞凋亡、而抑制癌細胞生長重要作用。這與既往報道結果相似，宋春麗等〔17〕分析SIRT3基因在肝癌細胞老化的作用，結果發現SIRT3基因過表達可以促進肝癌細胞衰老。Lee等〔18〕研究發現SIRT3過表達可以通過抑制Src/FAK信號通路達到抑制乳腺癌細胞的遷移的作用，從而降低癌細胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，SIRT3在膀胱癌中呈低表達，低水平SIRT3可促進膀胱癌發生；過表達SIRT3可抑制EMT發生而抑制癌癥發生和進展，有望成為膀胱癌轉移和侵襲過程中的一種新的生物治療靶點因子。但由于時間限制、樣本量小，尚未明確膀胱癌中SATBI誘導細胞EMT的信號通路，仍需設計更為嚴密的、多中心、大樣本、雙盲的研究進一步分析相關機制。