凝膠過濾色譜分離純化魚蛋白酶解產物

胡二坤，郭興鳳，鄭慧

1. 河南職業技術學院烹飪食品與健康學院（鄭州 450046）；2. 河南工業大學糧油食品學院（鄭州 450001）

魚蛋白粉經過蛋白酶水解，其產物具有一定的抗氧化活性。在食品工業中，為了更充分地利用魚蛋白酶解產物，尤其利用其自由基清除能力作天然食品抗氧化劑，有必要對其復雜的水解產物進行分離和純化，以提高水解產物的抗氧化效果。蛋白的酶解產物一般是多肽片斷或游離氨基酸，目前常用的分離純化方法有超濾、層析等。

凝膠過濾色譜法是以多孔凝膠為支持物，利用分子篩原理進行分離的方法，也是目前研究中常用的層析方法之一[1-2]。凝膠層析被廣泛用于脫鹽、蛋白質分離純化和相對分子質量的測定等方面，在魚蛋白酶解產物的分離方面也有應用。Venkatesan等[3]利用G-25葡聚糖凝膠分離純化北方鱈魚魚肉蛋白；莊永亮等[4]利用G-25葡聚糖凝膠層析法分離純化羅非魚魚皮抗氧化肽；江海萍[5]采用G-15葡聚糖凝膠層析法分離藍園鰺抗氧化活性肽。

此次試驗選用凝膠層析法對魚蛋白酶解產物進行分離純化，考察洗脫速度和上樣濃度對魚蛋白水解產物分離效果的影響，確定凝膠層析分離純化魚蛋白酶解產物的最佳條件，為后續分離純化組分的抗氧化活性研究奠定基礎。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

Sephadex G-15（Pharmacia公司）；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，諾維信（中國）生物技術有限公司）；還原型谷胱甘肽（純度＞99%，阿爾法化工有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）、無水乙醇等試劑均為分析純。

魚蛋白酶水解產物（實驗室自制）。制備條件：采用堿性蛋白酶（酶活3.0×105U/mL），在底物濃度18.05%、加酶量2.40%、水解pH 8.07、水解溫度48.84℃條件下進行酶水解，酶解液經真空濃縮、冷凍干燥后制成粉末。

1.2 試驗儀器與設備

儀器與設備見表1。

表1 儀器與設備

1.3 試驗方法

1.3.1 凝膠型號的選擇

理論上，蛋白質酶解后的氨基酸片斷與水解程度有關。隨著水解程度的增加，蛋白質的分解程度也增加，所得到的氨基酸片斷變小。蛋白質酶解程度和氨基酸片斷平均鏈長度的關系如式（1）所示[6]。

式中：AR為肽段的鏈長度。

蛋白水解物的平均相對分子質量與水解度有關。水解度越大，蛋白質肽鍵被切開得越多，肽鏈越短，相對分子質量越小[7]。試驗制備的魚蛋白水解產物的水解度為23.15%，可推斷出水解產物平均含有4～7個氨基酸，平均相對分子質量在520 Da左右[8]。G-15葡聚糖凝膠的分離范圍為100～1 500 Da，因此選取G-15葡聚糖凝膠作為分離用凝膠。

1.3.2 預處理及裝柱

此次試驗選用內徑為15 mm、高460 mm的中高壓色譜塔。根據凝膠的膨脹系數及柱體積稱取適量的凝膠，在沸水浴中煮沸并充分溶脹后，用蒸餾水潤洗3遍。裝柱前，先向凝膠柱中加入約1/4柱高的蒸餾水，排除柱子下端的氣泡，將潤洗好的凝膠緩慢傾倒入柱子中，使凝膠自然沉降。為了避免凝膠分層，盡可能一次性地將攪拌均勻的凝膠注入柱子中，若多次注入，每次傾倒凝膠前先攪起沉降的凝膠，再用上述方法傾倒。裝好的柱子呈現均一的狀態，無氣泡和分層。裝好的柱子用3～5倍柱體積的蒸餾水對裝好的凝膠柱進行平衡，使凝膠充分沉降[6]。

1.3.3 Sephadex G-15凝膠層析方法

儀器設定自動體積2 mL，采用280 nm紫外檢測分離產物，蒸餾水為洗脫液，系統自動收集分離樣品。考察洗脫速度和上樣濃度對魚蛋白水解產物分離效果的影響。

1.3.4 洗脫速度的選擇

上樣質量濃度為100 mg/mL，探究洗脫速度分別為1.5，2.0和2.5 mL/min對魚蛋白水解產物的分離效果。

1.3.5 上樣濃度的選擇

洗脫速度為2.0 mL/min，探究上樣質量濃度分別為75，100和125 mg/mL對魚蛋白水解產物的分離效果。

1.3.6 DPPH自由基清除率的測定

DPPH·清除率的測定步驟參見表2[9]。

表2 DPPH·清除率測定試驗步驟

各混合液充分振蕩、混勻，避光條件下反應30 min，在517 nm下測定吸光度。清除率按式（2）計算。

1.3.7 數據處理

采用Collection 2.0.0軟件進行凝膠層析峰的計算。

2 結果與討論

2.1 洗脫速度對魚蛋白水解產物分離效果的影響

在上樣質量濃度100 mg/mL、上樣體積2 mL條件下，考察洗脫速度對魚蛋白水解產物分離效果的影響，結果如圖1所示。一般情況下，低流速時凝膠層析的分離效果較好，但流速過慢會導致樣品擴散加劇，影響分離效果。流速過快可能會導致樣品未得到完全分離就在洗脫液沖洗下流出來，也會影響分離和收集效果[5]。由圖1可以看出，魚蛋白水解產物凝膠層析得到3個洗脫峰。當洗脫速度為1.5 mL/min時，由于洗脫速度慢、出峰慢，樣品擴散嚴重，洗脫出的譜帶變寬，峰形不夠尖銳，洗脫出來的峰拖尾嚴重，分離效果不理想。當洗脫速度為2.0 mL/min時，樣品得到較好的分離。當洗脫速度為2.5 mL/min時，洗脫出的峰與洗脫速度2.0 mL/min洗脫峰相比，第一個峰和第二個峰的重疊程度高，樣品未完全分離開。因此，選擇洗脫速度2.0 mL/min進行凝膠層析。

2.2 上樣濃度對魚蛋白水解產物分離效果的影響

在洗脫速度為2.0 mL/min、上樣體積2 mL條件下，考察上樣質量濃度對魚蛋白水解產物分離效果的影響，結果如圖2所示。在凝膠層析試驗中，上樣質量濃度過小和過大，均會影響分離效果。由圖2可以看出，當上樣質量濃度為75 mg/mL時，濃度過小，不利于收集組分。當上樣質量濃度為100 mg/mL時，分離效果理想，3個分離組分得到很好的分離。當上樣質量濃度為125 mg/mL時，濃度過高，導致樣品在洗脫柱的洗脫過程中，高濃度樣品向周圍擴散，造成分離出的峰重疊現象[7]，分離效果較差。因此，選取上樣質量濃度100 mg/mL進行凝膠層析。

圖1 洗脫速度對魚蛋白水解產物分離效果的影響

圖2 上樣質量濃度對魚蛋白水解產物分離效果的影響

通過以上研究，得出魚蛋白水解產物分離純化的最佳操作條件：上樣質量濃度100 mg/mL，上樣體積2 mL，蒸餾水洗脫，洗脫速度2.0 mL/min。在此操作條件下魚蛋白水解產物得到3個洗脫峰。

2.3 魚蛋白水解產物分離圖譜及分離組分的蛋白含量

在還原型谷胱甘肽上樣質量濃度50 mg/mL、魚蛋白水解產物上樣質量濃度100 mg/mL、上樣體積2 mL、蒸餾水洗脫、洗脫速度2.0 mL/min的條件下，將還原型谷胱甘肽和魚蛋白水解產物分別經過G-15葡聚糖凝膠層析柱，得到的分離圖譜如圖3所示。魚蛋白水解產物經過葡聚糖凝膠層析分離，按照出峰先后順序分別得到組分Ⅰ，組分Ⅱ和組分Ⅲ。魚蛋白分離組分的蛋白含量及所占的比例由表3所示。

魚蛋白粉經過酶解后會斷裂成不同長度的肽段。由圖3可以看出，魚蛋白水解產物經過G-15葡聚糖凝膠洗脫后出現3個洗脫峰，根據葡聚糖凝膠的分子篩原理，得知組分Ⅲ的相對分子質量最小，組分Ⅱ次之，組分Ⅰ相對分子質量最大。將還原型谷胱甘肽（MW=307.32，純度＞99%）經過洗脫通過G-15葡聚糖凝膠層析柱，得到一個洗脫峰。通過對比還原型谷胱甘肽和魚蛋白水解產物的洗脫峰，可估算出組分Ⅱ和組分Ⅲ的相對分子質量小于還原型谷胱甘肽。由表3可見，組分Ⅰ相比與其他兩個組分所占比例較大，為51.70%，組分Ⅱ和組分Ⅲ占的比例分別為13.90%和34.40%。

表3 魚蛋白分離組分蛋白含量

圖3 魚蛋白水解產物和還原型谷胱甘肽凝膠層析圖譜

2.4 魚蛋白酶解產物及分離組分的DPPH·清除能力研究

將魚蛋白水解產物及分離純化得到的組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ分別進行DPPH·清除能力的測定，結果如圖4所示。將測定數據進行擬合分析，得到各組分的DPPH·清除能力的IC50值，結果見表4。

由圖4可以看出，魚蛋白酶解產物和3個分離組分的DPPH·清除能力均隨著濃度的增大而增強。從圖4（a）中可以看出，當質量濃度為1.0～7.5 mg/mL時，隨著魚蛋白水解產物濃度的增加，其DPPH·清除率呈現顯著性增加（p＜0.05）；當魚蛋白水解產物質量濃度為2.1 mg/mL時，DPPH·清除率達到47.0%。由圖4（b）可見，當組分Ⅰ質量濃度為0.8～5.0 mg/mL時，其DPPH·清除率呈現顯著性增加；當質量濃度為1.6 mg/mL時，組分Ⅰ的DPPH·清除率為51.1%。組分Ⅱ的DPPH·清除能力由圖4（c）所示，當質量濃度為0.5～7.9 mg/mL時，組分Ⅱ的DPPH·清除率顯著性增強；當質量濃度為2.0 mg/mL時，組分Ⅱ的DPPH·清除率為33.6%。組分Ⅲ的DPPH·清除能力由圖4（d）所示，組分Ⅲ的DPPH·清除率在0.4～3.7 mg/mL質量濃度范圍內顯著增加，當其DPPH·清除率為55%時，組分Ⅲ的質量濃度為1.5 mg/mL。

由表4可見，魚蛋白水解產物經過G-15葡聚糖凝膠層析，組分Ⅰ和組分Ⅲ的DPPH·清除率明顯提高，組分Ⅱ的DPPH·清除率相比魚蛋白酶解產物變化不大。組分Ⅲ的DPPH·清除率最大，組分I次之，組分Ⅱ的DPPH·清除能力略低于魚蛋白水解產物的DPPH·清除能力，但均低于還原型谷胱甘肽和抗壞血酸的DPPH·清除能力。

圖4 魚蛋白水解產物及分離組分濃度對DPPH·清除能力的影響

表4 水解產物和分離組分的DPPH·清除能力測定結果 mg/mL

魚蛋白酶解產物對DPPH·清除作用是其可以向DPPH·提供電子或氫供體的疏水氨基酸暴露，使得魚蛋白水解產物具有清除DPPH·的能力[10]。魚蛋白水解產物提供電子或氫原子給自由基后，自身成為自由基中間體，中間體達到穩定態的時間和穩定態的穩定程度直接影響最終的自由基清除能力，還原型谷胱甘肽和抗壞血酸的DPPH·清除能力遠高于魚蛋白水解產物，原因可能是魚蛋白水解產物提供氫原子給自由基后，形成穩定中間體的速度較慢，時間較長[11]。

3 結論

此次試驗選擇G-15葡聚糖凝膠作為柱材料分離純化魚蛋白水解產物，通過改變凝膠層析色譜的上樣濃度和洗脫速度，確定G-15葡聚糖凝膠層析分離純化魚蛋白水解產物的條件：上樣質量濃度100 mg/mL，上樣體積2 mL，蒸餾水洗脫，洗脫速度2.0 mL/min。魚蛋白水解產物經過G-15葡聚糖凝膠層析，按相對分子質量大小得到3個分離組分：組分Ⅰ、組分Ⅱ和組分Ⅲ。3個分離組分的蛋白含量依次為83.70%，49.20%和36.91%，峰面積分別占51.70%，13.90%和34.40%。組分Ⅰ和組分Ⅲ的DPPH·清除率明顯提高，組分Ⅱ的DPPH·清除率相比魚蛋白酶解產物變化不大。