基于網絡藥理學預測川芎嗪、芍藥苷干預糖尿病血管并發癥的作用機制

岳 瓏，盛 松，王景尚，李丹丹，黃 燁

糖尿病已成為繼心血管疾病、腫瘤后的第三大危害人類生命及健康的慢性代謝性疾病[1]。多項全國多中心流行病學研究證實，我國成人糖尿病患病率高達9%以上，已成為我國重大公共衛生問題之一[2]。糖尿病血管并發癥是病人致死、致殘的主要因素[3]。探討糖尿病血管并發癥的發病機制并進行針對性治療是該領域亟待解決的關鍵問題之一。

中醫學認為糖尿病屬“消渴”范疇，糖尿病血管并發癥發生的機制是“瘀血痹阻脈絡”。大量臨床和基礎研究表明，中藥復方、單味藥及提取部位、單體成分可通過多途徑、多靶點防治糖尿病微血管并發癥和大血管并發癥[4]。其中，川芎嗪是由中藥傘形科植物川芎根莖提取的有效成分，對糖尿病并發癥包括周圍神經病變、視網膜病變、腎臟病變有預防和治療作用，其主要機制與改善微循環有關[5]。芍藥苷作為中藥材白芍和赤芍的主要活性單體成分，具有免疫調節、抗氧化反應、抗腫瘤、抗炎、改善學習記憶等藥理作用，廣泛應用于調節免疫、保護心腦血管、抗腫瘤、保肝等治療[6]。大量基礎研究多集中于川芎嗪和芍藥苷改善糖尿病腎病，川芎嗪可改善糖尿病大鼠的血液流變學、抑制醛糖還原酶活性、降低血糖、減少尿蛋白丟失、減輕腎臟病理變化[7]、抑制腎臟細胞凋亡、改善腎臟結構和功能[8]，從而延緩糖尿病腎病的發生和發展。芍藥苷可通過抑制糖尿病小鼠巨噬細胞活化、減輕炎癥反應，發揮對腎臟的保護作用[9]。川芎嗪、芍藥苷配伍具有復雜的藥理作用，其干預糖尿病血管并發癥的具體機制尚不明確，需進一步深入研究。

網絡藥理學從多靶點、多成分、多通路著手研究藥物與疾病間相互作用的原理，符合中醫的整體觀，為中醫藥機制的研究提供更為完善的方法[10]。本研究基于網絡藥理學方法，對川芎嗪和芍藥苷干預糖尿病血管并發癥的作用通路及相關靶點進行探討，以明確其防治糖尿病血管并發癥的物質基礎。

1 材料與方法

1.1 川芎嗪、芍藥苷靶點預測 在ZINC數據庫中得到芍藥苷和川芎嗪的SMILES、mol2文件及InChI。在DrugBank 5.0、SwissTargetPrediction ver 2019、SEA、Batman-TCM、 PharmMapper ver 2017中分別通過SMILES、mol2、InChI找到川芎嗪及芍藥苷的成分靶點。DrugBank 5.0篩選條件設為Similarity threshold 0.7，Minimum Weight e.g.100，Maximum Weight e.g.200，Maximum Results 100。SwissTargetPrediction ver 2019篩選條件設定為Organism Homo sapiens。PharmMapper ver 2017篩選條件設為Organism Homo sapiens(Human)。Batman-TCM篩選條件設為Score cutoff≥20，AdjustedP-value為 0.05(檢索截至日期為2019年11月7日)。

1.2 糖尿病血管并發癥的疾病靶點檢索與篩選 采用GeneCards數據庫、DrugBank數據庫(https：//www.drugbank.ca/)和DisGeNET數據庫(http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home)檢索糖尿病血管并發癥疾病相關靶點，整理后建立疾病相關靶點數據庫(檢索截至日期為2019年11月7日)。

1.3 川芎嗪和芍藥苷治療糖尿病血管并發癥的靶點篩選 將獲得的川芎嗪和芍藥苷成分靶點匯總后去除重復項，再與糖尿病血管并發癥的疾病靶點取交集，即為川芎嗪和芍藥苷作用于糖尿病血管并發癥的靶點。

1.4 蛋白質之間相互作用(PPI)的網絡構建 PPI是生物分子網絡中的基本組成元件，是疾病發生發展的關鍵環節[11]，因此，應用String v11數據庫獲取靶標蛋白質相互作用關系，從PPI層次探討川芎嗪、芍藥苷的潛在作用機制。將得到的靶點交集蛋白質信息輸入到String數據庫，物種設為“Homo sapiens”，根據既往文獻，最低相互作用閾值設為中等置信度“medium confidence(0.400)[12]”，同時設置“hide disconnected nodes in the network”以隱藏網絡中無關聯的節點，構建PPI關系。

1.5 成分靶點-疾病靶點網絡構建以及核心靶點的篩選 將上述得到的PPI關系導入Cytoscape 3.2.1軟件，利用“Network Analyzer”工具進行網絡拓撲分析，以節點的自由度(degree)、中介中心性(betweenness centrality，BC)和接近中心性(closeness centrality，CC)網絡拓撲參數來評估節點的重要程度，上述參數值越大，提示節點越接近網絡中心，在網絡拓撲學上的作用也越大。以Degree>2倍均值為初次靶點篩選，從初次篩選出的靶點中以Degree、BC、CC值均大于均值的靶點作為核心靶點[13]。

1.6 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 首先對所得靶點進行ID名稱的切換，即使用R軟件將川芎嗪、芍藥苷與糖尿病血管并發癥的共作靶點轉化為EntrezID；其次調用R語言中的ClusterProfiler程序包進行數據處理；最后運行R語言得到GO富集分析中生物過程(BP)的條形圖和KEGG富集分析的氣泡圖[14]。

2 結 果

2.1 川芎嗪、芍藥苷靶點預測 在DrugBank 5.0、SEA中未找到川芎嗪和芍藥苷的靶點，在SwissTargetPrediction ver 2019中得到29個川芎嗪靶點和100個芍藥苷靶點，Batman-TCM中得到8個川芎嗪靶點，在PharmMapper ver 2017中得到66個川芎嗪靶點和68個芍藥苷靶點，匯總后去除重復項共得到103個川芎嗪靶點和168個芍藥苷靶點。

2.2 糖尿病血管并發癥的疾病靶點檢索 在GeneCards中找到4 662個靶點，在DrugBank 5.0中找到65個靶點，在DisGeNET中未找到靶點，匯總后去除重復項得到4 662個糖尿病血管并發癥靶點。

2.3 川芎嗪和芍藥苷作用于糖尿病血管并發癥的靶點 將找到的成分靶點與疾病靶點取交集，即為川芎嗪和芍藥苷作用于糖尿病血管并發癥的靶點，共146個。經篩選后得到4個核心靶點：TP53、HSP90AA1、STAT3和ANXA1。詳見表1。

表1 川芎嗪和芍藥苷作用于糖尿病血管并發癥的4個核心靶點

2.4 成分靶點-疾病靶點網絡構建 成分靶點-疾病靶點網絡中有144個節點和853條邊，代表著網絡中144個靶點和853個靶點間的關系。詳見圖1。

圖1 成分靶點-疾病靶點網絡

2.5 GO富集分析結果 共富集到1 280個Biological Process，按照AdjustedP值由小到大排列選出富集最顯著的10個條目。其中，smooth muscle contraction，vascular process in circulatory system，regulation of blood vessel size，vasoconstriction[15]以及positive regulation of MAPK cascade[16]等生物過程可能與糖尿病血管并發癥存在聯系。詳見圖2。

圖2 GO富集分析結果

2.6 KEGG富集分析結果 KEGG富集通路符合adjustedP<0.05的有42條，包括Neuroactive ligand-receptorinteraction，Calcium signaling pathway，Serotonergic synapse，Inflammatory mediator regulation of TRP channels， cGMP-PKG，Dopaminergic synapse通路，將富集最顯著的前30條通路作圖(見圖3)。這些通路可能與糖尿病血管并發癥的發生有關。

3 討 論

川芎嗪是一種自由基清除劑及鈣離子拮抗劑，具有活血化瘀、抑制血小板聚集、降低血液黏度、改善血液流變學的作用，已廣泛應用于心、腦、肺、腎及血管疾病的治療。此外，研究表明，川芎嗪對防止糖尿病的各種慢性并發癥均具有顯著療效[17]。芍藥苷具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗血小板聚集、免疫調節和緩解疼痛等作用[18-19]。課題組前期研究表明，芍藥苷通過拮抗氧化應激、抑制炎癥反應、下調蛋白激酶Cβ1發揮保護波動性高血糖誘導的內皮細胞損傷[20]。

本研究應用網絡藥理學探討川芎嗪和芍藥苷配伍防治糖尿病血管病變的物質基礎，發現從川芎嗪和芍藥苷中分別篩選出成分靶點103個和168個，與4 662個糖尿病血管并發癥靶點取交集得到146個靶點，網絡拓撲分析得到4個核心靶點：TP53、HSP90AA1、STAT3和ANXA1，這些成分可能是兩者治療糖尿病血管并發癥的重要靶點。對靶點相關的信號通路及生物學過程富集分析結果提示，刺激神經組織的配體-受體相互作用通路、鈣離子信號通路、Serotonergic synapse、調控瞬時受體電位通道(transient receptor potential，TRP)的炎癥介質、環鳥苷酸(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號轉導通路、多巴胺能神經突觸可能參與了糖尿病血管病變的疾病過程。

抑癌基因TP53，也稱p53，是人類癌癥中最常見的突變基因之一，在癌癥發生、衰老和DNA修復等過程中具有核心作用[21]。研究表明，血管內皮生長因子的升高與糖尿病病人發生大血管病變有關[22]，而p53可抑制血管內皮生長因子轉錄[23]。有研究表明，p53激活在衰老過程中起到刺激炎癥、減弱干細胞更新能力的作用，此外，脂肪組織p53過表達會引起胰島素抵抗。因此，降低p53活性可能是減緩衰老、抑制炎癥、促進胰島素重新發揮作用的合理策略[24]。

祖細胞(HSPC)/熱休克蛋白90(HSP90)和內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)形成的復合物是Akt介導eNOS激活進而生成一氧化氮的先決條件[25]。糖尿病大鼠體內的高葡萄糖環境會降低HSP90表達，相反，二甲雙胍通過誘導eNOS磷酸化增強HSPC-eNOS相互作用，在一定程度上阻止一氧化氮合成，降低一氧化氮對血管內皮舒張功能，從而加劇微血管并發癥的發展[26]。HSPC在人類動脈粥樣硬化病變中上調[27]，而應用HSPC抑制劑17-DMAG治療鏈脲佐菌素誘導的糖尿病ApoE-/-小鼠可明顯減少動脈粥樣硬化病變并誘導更穩定的斑塊表型[28]。

信號轉導與轉錄活化因子(STAT3)是一種轉錄因子，可被MAPK激活，直接或間接促進血管新生、誘導細胞增殖、分化以及凋亡[29]，被認為是血管功能障礙中病理信號集成的中心介質。STAT3在KEGG富集中與糖尿病血管并發癥相關的通路主要包括胰島素抵抗通路和晚期糖基化終末產物(AGEs)及其受體(AGEs-RAGE)信號通路。研究表明，STAT3-細胞因子信號轉導抑制因子3(SOCS3)信號參與胰島素抵抗的形成過程，在2型糖尿病的發病機制中發揮重要作用[30]。正常情況下，內皮細胞僅少量表達RAGE，但在糖尿病狀態下，伴隨循環中及內皮下基質AGEs的增多，內皮細胞RAGE的表達也增強，AGEs與RAGE相互作用使內皮細胞一系列功能發生改變[31]。

ANXA1是一種天然存在的抗炎蛋白，屬于Annexin超家族，是糖皮質激素的重要第二信使，在血管內皮細胞和血管平滑肌細胞中表達，參與許多抗炎過程[32]。研究表明，內源性ANXA1可能在胰島素抵抗中發揮重要的血管保護作用。與傳統抗炎策略相比，基于ANXA1的治療可減少糖尿病血管損傷[33]。Purvis等[34]研究首次發現1型糖尿病病人血漿中存在高水平ANXA1。同時，在1型糖尿病動物模型中亦發現內源性ANXA1在保護心臟和腎臟免受功能衰退方面至關重要。推測人類重組ANXA1可能成為1型糖尿病微血管并發癥的干預新措施。

糖尿病血管病變的發病機制目前尚未完全闡明，多數學者認為其根源是由糖尿病病人體內糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂所誘發的一系列病理生理變化，這些異常改變又與組織蛋白非酶糖基化、自由基代謝和脂質過氧化及細胞凋亡等因素有關。近年來，大量證據表明炎癥在與肥胖相關的胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病發生發展中具有至關重要的作用，這些異常改變導致組織生理功能障礙和結構損傷，終致糖尿病血管并發癥[35]。因此，積極防治糖尿病并發癥對降低病殘和病死率意義重大。本研究基于網絡藥理學，探究川芎嗪及芍藥苷對糖尿病血管并發癥的作用通路、作用靶點及作用機制，發現其主要通過調控血管平滑肌作用、控制血小板適度活化、抗炎、控制細胞代謝及凋亡等過程共同發揮減輕糖尿病血管并發癥進展的作用，為后期明確防治糖尿病血管病物質基礎提供依據。