紅參水煎液對斑馬魚血管生長干預作用的實驗研究

石秀娟，邱伯雍，魏易洪，吳 瓊，鄧 兵，湯 諾，周 端，唐靖一

心肌缺血是多種心血管疾病發生發展的重要機制，血管新生可促進血管側支循環建立，改善心肌血供，是治療缺血性心臟疾病的重要研究方向[1]。目前認為人參可有效抗心肌缺血，具有很好的心臟保護作用[2]。而作為人參炮制品的紅參，是否具有促進血管生長的作用目前尚不清楚。

斑馬魚是一種較好的模式動物，廣泛用于各項藥理研究中，亦用于血管生長的研究。既往研究發現，生曬參水煎液雖然不能促進斑馬魚正常的血管生長，但在較低濃度時可以抑制血管內皮生長因子酪氨酸酶抑制劑Ⅱ(VEGF receptor kinase inhibitor Ⅱ，VRI)誘導的血管損傷，說明生曬參有一定的促進血管生長作用[3]。本研究以紅參為研究對象，建立斑馬魚正常血管生長模型和血管損傷模型，使用紅參水煎液進行干預，觀察其對血管生長的藥理作用，為后續的研究奠定相關基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 轉基因斑馬魚(Fli1a-EGFP)由上海中醫藥大學附屬龍華醫院斑馬魚實驗室提供，使用自動循環系統進行喂養，方法同文獻[3]。

1.2 藥物、試劑及儀器

1.2.1 藥物 紅參飲片購自上海雷允上藥業有限公司(批號：1712010)，使用10倍于生藥的蒸餾水，大火煎煮至沸騰，小火微沸濃縮后再次加入蒸餾水，紗布過濾后，煎煮濃縮，制備成1 g/mL紅參儲備液，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 試劑 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司；VRI購自德國Calbiochem公司，用DMSO溶解成50 mmol/L儲備液，-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 儀器 培養箱購自德國Heraues公司；Ti-U熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅參水煎液對正常斑馬魚模型的作用 選擇3～12個月齡的成熟斑馬魚，進食2 h后按照雌雄1∶1或者1∶2放入產卵缸中，用隔板隔開，適應一晚后，第2天亮燈前抽去隔板，使斑馬魚產卵。將受精卵放入裝有胚胎培養液(embryo medium，EM)的培養皿中，于28.5 ℃培養箱孵育24 h，選擇狀態良好的斑馬魚胚胎，顯微鑷下攝去胚胎卵殼。

紅參水煎液各濃度組采用EM水將紅參儲備液稀釋至不同濃度(1 μg/mL、3 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL)，按照每孔1 mL加入24孔板后，加入斑馬魚幼魚每孔8條，空白對照組為1 mL培養液，孵育24 h后更換培養液及藥液，繼續孵育24 h后熒光顯微鏡觀察腸下血管。

1.3.2 紅參水煎液對VRI誘導血管損傷斑馬魚模型的作用 選擇在恒溫箱中孵育24 h、發育相近的斑馬魚胚胎，用顯微鑷攝去胚胎卵殼。VRI(50 mmol/L)用EM水稀釋至0.2 μmol/mL，按照每孔1 mL加入24孔板后，加入斑馬魚幼魚每孔8條，空白對照組加入1 mL培養液，VRI組加入1 mL的0.2 μmol/mL VRI，于恒溫箱中孵育24 h，24 h后，抽棄原飼養液，紅參水煎液各濃度組用EM水將紅參儲備液稀釋至不同濃度(1 μg/mL、3 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、100 μg/mL)，按每孔1 mL加入24孔板，空白對照組、VRI組各加入1 mL EM水，放回恒溫箱中繼續孵育24 h后，熒光顯微鏡觀察脊背節間血管。

1.4 觀察指標及方法 將孵育好的斑馬魚放置于載玻片上，吸去多余水分，于熒光倒置顯微鏡下觀察血管。正常斑馬魚模型：觀察腸下血管條數、交叉及出芽，計算平均出芽數(出芽數/該組斑馬魚數)、平均交叉數(交叉數/該組斑馬魚數)，ImageJ測量血管直徑。VRI誘導血管損傷斑馬魚模型：觀察脊背節間血管個數(完整血管和缺陷血管)。方法參照文獻[3]。

2 結 果

2.1 紅參水煎液對斑馬魚腸下靜脈的作用 與空白對照組相比，紅參水煎液3 μg/mL組、30 μg/mL組、100 μg/mL組平均出芽數明顯增多(P<0.01)，紅參水煎液各濃度組平均交叉數比較差異無統計學意義(P>0.05)，紅參水煎液10 μg/mL組腸下血管直徑有所增加(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 各組平均出芽數、平均交叉數、血管直徑比較

圖1 紅參水煎液對斑馬魚腸下血管的作用

2.2 紅參水煎液對VRI誘導斑馬魚血管損傷模型的作用 與空白對照組相比，VRI組及紅參水煎液各濃度組完整血管明顯減少，缺陷血管增多，差異均有統計學意義(P<0.01)；與VRI組相比，紅參水煎液1 μg/mL組完整型血管有所增多(P<0.05)，紅參水煎液3 μg/mL組、10 μg/mL組、30 μg/mL組、100 μg/mL組完整型血管明顯增多(P<0.01)，紅參水煎液10 μg/mL組、100 μg/mL組缺陷血管明顯減少(P<0.01)。詳見表2及圖2。

表2 各組完整血管、缺陷血管比較(±s) 單位：條

圖2 紅參水煎液對斑馬魚節間血管的作用

3 討 論

紅參是由人參經高溫蒸制等工序加工后得到，在化學成分上較生曬參更為豐富，并產生人參皂苷Rg3等特有的化合物[4]，具有很好的藥理作用。在抗疲勞、抗衰老等方面，黃寶亮等[5]發現紅參中的精氨酸雙糖苷可改善小鼠力竭性游泳所致疲勞及免疫功能，具有抗疲勞及增強免疫的功效；曾露露等[6]使用紅參提取物干預D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠，發現紅參提取物有明顯的抗衰老作用，機制可能與增強機體免疫能力、清除自由基和炎性因子有關。此外，紅參還有很多其他功效，如金光日等[7]使用紅參水提物對哮喘小鼠氣管炎癥進行治療，發現紅參水提物可以抑制氣管炎癥，且可能通過抑制NF-κB p65等核轉錄因子來調節Th2；金玲等[8]發現紅參皂苷Rg5可以降低1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶離子(MPP+)誘導的SH-SY5Y細胞活性氧族(ROS)和酪氨酸羥化酶表達水平，改善神經細胞氧化應激狀態；梁鈺彬等[9]發現紅參提取物可以促進人臍靜脈內皮細胞合成與一氧化氮釋放，降低內皮素-1含量，發揮舒張血管作用。由此可見，紅參藥效的多效性值得深入研究。

促進血管生長是治療心血管疾病的主要研究方向，而紅參是否具有促進血管生長作用的報道不多。本研究在正常斑馬魚模型中發現，紅參水煎液雖然不能增加斑馬魚腸下靜脈的交叉數，但在一定濃度時可增加腸下靜脈的出芽數和增加斑馬魚腸下靜脈的直徑。而在VRI誘導的血管損傷模型中，使用VRI進行血管損傷模型構建。VRI可以阻斷血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路，而后者主要通過VEGF/VEGF受體(VEGFR)通路發揮促進血管生長的作用，是重要的生長因子[10]，亦是重要的干預對象。本研究發現，紅參水煎液各濃度均有一定的恢復血管生長的作用，并且10 μg/mL時效果最好。這些結果均說明紅參有一定的促進血管生長作用，并且與前期生曬參水煎液比較[3]，紅參水煎液促進血管生長的效果似乎更穩定和明顯。孫娜等[11]將近20年中國知網、萬方、維普等數據庫中關于人參及炮制品的文獻資料進行總結后發現，在人參加工成紅參過程中，產生了紅參特有成分，包括人參皂苷Rh2、Rs1等，并使人參在抗腫瘤、抗疲勞、抗衰老及促進組織血液循環方面的活性增強。張淼等[12]亦認為，人參經過加工炮制后，所含有效成分如皂苷類、揮發油、糖類等均發生復雜變化，并同時伴有新的物質生成。當然，紅參與生曬參到底有哪些物質成分差異，其藥效有哪些異同還需更多的研究證實，并且此次研究中，紅參促進血管生長的藥效較生曬參似乎更好，是否與炮制過程中的物質變化有關需要進一步研究。而趙遠等[13]建立的大鼠脾氣虛證模型，采用生曬參之四君子湯與紅參之四君子湯進行觀察比較，發現兩組均有較好的血管保護作用，但以生曬參更優。這說明紅參與生曬參各有治療側重點，在臨床應用中還是要靈活機變，辨證論治，達到最好療效。

總之，本研究發現紅參具有一定的促進血管生長作用，并且可能與VEGF有關。在后續研究中可以使用小鼠或大鼠進一步進行觀察和驗證，以得到更強有力的證據。