2'-巖藻糖基乳糖預防嬰幼兒壞死性小腸結腸炎及感染性腹瀉的研究進展

陸夢蘭，陳財龍，徐加英，石羽杰，蘇紅文，劉 彪，秦立強,

（1.蘇州大學公共衛生學院，江蘇蘇州 215123；2.蘇州大學放射醫學與防護學院，江蘇蘇州 215123；3.內蒙古伊利實業集團股份有限公司金山分公司，內蒙古呼和浩特 010110）

母乳成分獨一無二，包含各種生物活性物質。母乳低聚糖（human milk oligosaccharides, HMOs）是母乳中一種特殊的碳水化合物，是母乳中除乳糖和脂肪以外的第三大成分，由單糖及衍生物、唾液酸等結構單元通過糖苷鍵連接而成[1]。隨著國外首次實現HMOs的商品化應用，使得HMOs研究成為母乳研究的一大熱點，具有巨大的學術與經濟價值。2'-巖藻糖基乳糖（2'-fucosyllactose, 2'-FL）作為HMOs的主要成分之一，具有調節腸道菌群、抗菌黏劑、免疫調節劑等重要的生物學功能[2?3]。

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是早產兒常見的一種非炎性小腸紊亂，早產兒NEC的高發病率與腸道發育不成熟密切相關，并受飲食和細菌定植的影響[4]。嬰幼兒消化和免疫功能不全、腸道發育不成熟還是導致腹瀉病的重要原因。2'-FL不僅可以作為益生元，還可能作為抗黏附抗菌劑和腸上皮細胞及免疫應答的調節劑，通過調節免疫系統和腸道菌群對NEC和腹瀉病產生顯著影響[5]。因此，本文綜述了2'-FL的安全性及調節腸道菌群與免疫系統，尤其是其對嬰幼兒NEC和感染性腹瀉的預防作用。

1 母乳中的2'-FL

目前已鑒定出約200種HMOs分子，以中性的巖藻糖基化HMOs為主，2'-FL約占泌乳母親HMOs總量的30%，由乳糖的半乳糖殘基通過α-1,2鍵連接巖藻糖而形成。在不同婦女及整個哺乳期，HMOs的種類和含量不同，泌乳早期較高，并隨時間逐漸降低[6]。HMOs隨母乳直接進入小兒消化系統，只有不到5%被消化分解，絕大部分以原型隨尿排出。

HMOs的組成反映了Lewis血型特征和泌乳狀態，取決于某些糖基轉移酶的表達。血型特征決定了特異性的巖藻糖轉移酶2（FUT2）和FUT3的表達。分泌型母乳具有豐富的2'-FL和其他α1-2-巖藻糖化HMOs。相反，非分泌型母乳因缺乏FUT2，不含或者僅含少量2'-FL和其他α1-2-巖藻糖化HMOs[7?8]。另外，地理條件和環境因素也會影響HMOs中2'-FL的含量[1]。

2 2'-FL的安全性

在一項幼年大鼠亞慢性毒性研究中，使用不同劑量的2'-FL連續灌胃90 d，對照組采用目前認為安全并被批準用于嬰兒配方奶的果寡糖。根據整體觀察、體重、攝食量、眼底檢查、器官重量、組織病理學綜合評價，5000 mg/kg無任何不良反應，因此該劑量為未觀察到有害作用水平（NOAEL），6000 mg/kg高劑量干預在體外也未檢測到致突變性[9]。大量的臨床試驗評估了復雜的HMOs混合物用于嬰幼兒食品的安全性，只有少數考慮了補充2'-FL配方的效果。潘麗娜等[10]用1 g/kg和2 g/kg 2'-FL的配方奶粉飼喂小鼠28 d，不但對小鼠的生長性能無影響，還提高了粗脂肪、鈣、磷等營養物質的消化利用率。一項具有前瞻性的隨機對照研究評估了含0.2 g/L或1.0 g/L的2'-FL與含2.2 g/L或1.4 g/L的低聚半乳糖的嬰兒配方奶粉對美國28個地區從出生到4個月期間健康足月兒生長的耐受性和安全性，母乳喂養或64.3 kcal/dL配方奶喂養的嬰兒在體重、長度和頭圍方面沒有顯著差異，未發生不良事件，而且配方奶粉和母乳喂養嬰兒的2'-FL吸收代謝情況相似[11]。添加2'-FL的配方奶粉喂養的嬰兒具有正常的生長模式和排便。目前還沒有關于2'-FL不良反應的報道。因此，2'-FL是一種安全的嬰兒配方奶粉的補充劑。

2'-FL的化學結構簡單，可以通過工業手段規模生產。目前以基因工程方法為主，通過大腸桿菌菌株和酵母的微生物發酵產物生產2'-FL[12?14]。美國食品和藥物管理局（FDA）將2'-FL、2'-O-巖藻糖基乳糖（2'-O-FL）和乳糖-N-新四糖（LNnT）三種 HMOs分類為安全的嬰兒配方奶粉添加物。歐盟視HMOs為新型食品，2'-FL和LNnT均已通過安全性評價[15]。2019年歐洲食品安全局（EFSA）對2'-FL進行了評估[16]：“對于1歲以上的幼兒2'-FL和二巖藻糖乳糖（DLF）混合物用于嬰兒配方奶粉、嬰幼兒食品中，每日最大攝入量不超過4 g是安全的”。因此，2'-FL添加于嬰兒配方奶粉有良好的前景。

3 2'-FL對腸道成熟及腸道菌群的影響

2'-FL能刺激上皮細胞的成熟，2'-FL單獨或與3'-FL、6'-唾液酸乳糖（6'-SL）聯合使用均可降低細胞增殖，增加腸上皮HT-29和Caco-2Bbe細胞的分化[17]。健康乳鼠口服2'-FL僅僅8 d就能顯著提高小腸絨毛高度和面積，絨毛寬度也有增加趨勢[18]。另外，用2'-FL和3'-SL干預大鼠8周后，明顯增加了雌鼠盲腸重量和腸道通透性，并上調維持腸道屏障功能的重要基因mRNA表達，而且干預改善了雄鼠和雌鼠的腸道菌群的組成，有益腸道微生物增多[19]。因此，2'-FL能促進腸道成熟，并與調節腸道菌群有關。

嬰兒出生時胃腸道從母親和周圍環境中獲得乳酸菌、腸桿菌和鏈球菌定植，一周后出現雙歧桿菌、擬桿菌和梭狀芽胞桿菌。最近的一項縱向研究隨訪了5周齡嬰兒至6~11歲，糞便微生物群分析結果表明，飲食是13周齡以后嬰兒微生物群組成最重要的決定因素，母乳喂養的嬰兒與嬰兒配方奶粉喂養的嬰兒腸道菌群組成不同[20]。順產分娩和母乳喂養的嬰兒往往免疫疾病發生率低，微生物群組成更健康，其腸道中雙歧桿菌和乳酸菌占據主導地位，而大腸桿菌和其他兼性厭氧微生物則處于劣勢。停止母乳喂養后，母乳喂養和配方奶喂養的嬰兒之間差異消失[21]。早產兒糞便中變形桿菌的相對豐度增加，厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度降低，因此，優化早產兒腸道菌群是預防NEC的一種新策略[22]。2'-FL能提高雙歧桿菌在腸粘膜上黏著能力[23]，并選擇性地促進雙歧桿菌的生長，主要是長雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌，還可以刺激一些擬桿菌種類的生長[24?25]。這些細菌會產生短鏈脂肪酸等代謝產物，降低腸道的pH，促進腸上皮細胞再生，影響微生物群落的組成，限制有害微生物的生長和定植[26?27]。體外研究顯示在含2'-FL的培養基上沒有腸道桿菌科菌株生長，而含低聚半乳糖的培養基上包括病原體在內的一些腸道桿菌菌株生長良好[28]。另一項體外研究則發現大腸桿菌可同化利用攝入2'-FL后產生大量的醋酸鹽從而使其相對豐度顯著增加[29]?？傊?，2'-FL能增加有益菌比例和菌群豐度、促進腸道成熟，從而保護腸道免受外界刺激的損傷。

4 2'-FL的免疫調節作用

早期的研究認為2'-FL通過增加腸道中有益微生物的數量，從而增加了抗炎細胞因子、降低促炎細胞因子的表達，調節嬰兒的免疫系統。但體外研究結果表明，2'-FL可以直接影響免疫細胞和細胞因子[30]。HMOs調節淋巴細胞的產生，促進T細胞反應向更平衡的Th1/Th2細胞因子轉變[31]。2'-FL通過誘導IL-10（+）T調節細胞和穩定肥大細胞減輕食物過敏癥狀[32]。粘膜中樹突狀細胞表達的特殊糖結合蛋白可識別人乳低聚糖，發揮生理和免疫作用。2'-FL與樹突狀細胞特異性C型凝集素樣細胞表面受體結合，直接與先天免疫細胞相互作用，從而改善了嬰兒的適應性免疫[33]。2'-FL可以通過支持細菌CpG DNA調節腸上皮細胞釋放半乳糖凝集素和TGF-βl的作用，促進腸道黏膜免疫發育[34]。

2'-FL還是固有性免疫系統的激活物，直接抑制炎癥信號。在1型菌毛腸毒素性大腸桿菌侵襲的腸上皮細胞模型中，2'-FL通過調節CD14表達，抑制了脂多糖（LPS）誘導的炎癥反應[35]。在鼠流感疫苗接種模型中，2'-FL飲食改善了疫苗接種小鼠的體液和細胞免疫應答，顯著增加小鼠脾臟細胞中疫苗特異性CD4+和CD8+T細胞以及γ干擾素[36]。因此，2'-FL對固有免疫與獲得性免疫都具有一定的調節作用。

5 2'-FL對壞死性小腸結腸炎的作用

NEC嚴重威脅出生體重極低嬰兒的生命安全。母乳喂養、提高母乳質量、標準化喂養制度可降低NEC的發生率，而長時間不進食與NEC發病率和嚴重程度增加有關，因此出生后應盡快進行母乳喂養[37?39]。NEC的特點是腸缺血和壞死，其發病與人工喂養、微生物失調和過度炎癥等有關，因此，降低促炎因子，誘導血管舒張分子內皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達，保護小腸黏膜結構、維持腸系膜灌注，可以在一定程度上減少NEC的發生發展[40?41]。一些動物模型研究了2'-FL對NEC的保護作用。2'-FL能減少NEC模型新生小鼠和仔豬的凋亡、炎癥反應、體重減輕和組織學改變，從而降低NEC的發生發展，其分子機制是2'-FL降低了TLR4介導的NF-κB 炎癥信號[42?43]。2'-FL 還降低了 NEC 新生小鼠的促炎因子水平并保留了小腸黏膜結構，但2'-FL不能保護eNOS敲除小鼠或預先給予eNOS小鼠的NEC，進一步說明eNOS在改善NEC中的作用[42?43]。用低溫低氧誘導小鼠幼崽NEC后給予2'-FL，僅3 d就能降低腸上皮細胞TLR4的表達，加速隱窩細胞的更新，保護腸上皮細胞免受損傷[44]。

動物實驗雖然發現2'-FL保護NEC，但其程度不及混合HMOs[45]。用富含2'-FL的嬰兒配方乳喂養剖腹早產豬5 d，2'-FL組出現NEC的比例低于對照組（50%vs.71%），但無統計學差異，兩組腸道微生物群、腸結構和消化功能也無顯著差異，這可能是早產豬腸道的定殖和腸道免疫還不成熟[46]。一項多中心臨床隊列研究顯示，發生NEC的極低出生體重兒的母乳中的HMOs各組分，除了二唾液酸乳糖-N-四糖濃度明顯降低，其他組分與對照組無明顯差異[47]。也有證據表明，在早產兒出生后幾周的配方奶中添加2'-FL對NEC敏感性沒有影響。當腸道已經適應喂養和細菌定植時，將2'-FL引入早產兒的喂養可能更有利于改善腸道健康。2'-FL對NEC的效果還需要進一步研究。

6 2'-FL對感染性腹瀉病的作用

在低收入和中等收入國家，腹瀉仍然是5歲以下兒童患病和死亡的主要原因。針對五種病原體（輪狀病毒、志賀氏菌、耐熱性腸毒素大腸桿菌、隱孢子蟲、典型的腸道致病性大腸桿菌）采取干預措施，可大大減輕中度至重度腹瀉的負擔[48]。許多病毒、細菌或原生動物病原體需要附著在粘膜表面，在宿主上定植或入侵引起腹瀉。攝入2'-FL可使耐熱性腸毒素大腸桿菌在小鼠腸道的定植率降低90%以上，并可降低腸道炎癥，增加糞便短鏈脂肪酸含量，增強腸道屏障功能，預防耐熱性腸毒素大腸桿菌感染[49]。另外一個研究也發現2'-FL能顯著抑制產腸毒素大腸桿菌F18定植于仔豬腸上皮細胞，但對減緩F18感染的仔豬腹瀉的作用有限[50]。2'-FL不但能提供非致病性共生體競爭優勢控制病原體，而且還可以直接與病原體結合，減少腸道上皮表面接觸微生物。大腸桿菌的熱穩定性腸毒素STa通過與腸道粘膜結合的冠苷酸環化酶結合并刺激其產生cGMP而引起腹瀉。在人結腸腺癌T84細胞中，2'-FL與冠苷環化酶受體結合，抑制了STa引起的氯離子穩態失衡[51]。2'-FL還能抑制彎曲桿菌在小鼠體內定植，抑制侵襲性致病性彎曲桿菌在體外與人腸道粘膜的結合[52]。

諾如病毒是嬰兒腹瀉的主要原因之一。在感染過程中，2'-FL通過模仿組織血型抗原（HBGAs）并結合在HBGA口袋中作為天然誘餌，阻止諾如病毒與其他血型抗原受體結合，保護嬰兒免受諾如病毒的感染[53]。LAUCIRICA等[54]驗證了 4種 HMOs在人諾如病毒G1P[8]和G2P[4]感染的非洲綠猴腎上皮細胞（MA104細胞）中的作用，在感染開始加入2'-FL使 G1P[8]的傳染力下降 62%，但 3'-唾液乳糖（3'SL）+ 6'-唾液乳糖（6'SL）降低 G2P[4]傳染力的能力更明顯。因此，在配方乳中添加2'-FL有利于人工喂養的嬰兒預防感染性腹瀉病。

7 小結

2'-FL是HMOs的主要成分之一，動物和人群研究沒有發現添加2'-FL的副作用，2'-FL有益于嬰幼兒腸道菌群和免疫系統發展成熟。配方奶粉中添加2'-FL對嬰幼兒腹瀉病和壞死性小腸結腸炎有一定的保護作用。深入研究2'-FL對免疫系統和腸道微生物的有益作用機制，有助于為早產兒或易患病的特定嬰兒群體開發新型和更有針對性的2'-FL嬰兒配方奶粉。添加2'-FL雖然可行，但還需要大規模的隊列研究以及以NEC為主要結局的隨機臨床試驗來驗證其效果及長期適應性和耐受性。此外，還需要進行臨床前動物研究以探究其作用機制，以及2'-FL補充的最佳時間。另外，利用HMOs作為益生元對菌群可能存在選擇性，6種母乳低聚糖的混合物能劑量依賴性地限制細胞因子誘導的FD4易位，并提高腸上皮屏障保護能力，2'-FL則發揮了關鍵作用[55]。因此，2'-FL與其他寡糖組合作為嬰兒配方奶粉的補充劑也具有深遠意義，需進一步研究其相互作用。最后，中國母乳HMOs數據有限，我國還缺乏2'-FL在食品行業中使用的相關標準，制備2'-FL的菌種選擇、工藝路線設計、產品形態等均沒有定論，因此，亟需國內研究機構和企業從基礎理論到產品研發進行原創性研究，為特定的嬰兒目標群體制定配方，服務于嬰幼兒健康成長。