納豆激酶的質量與安全評價研究進展

王露露，陳楠楠，曹夢思，李 斌，彭雪菲，劉 捷，張 靜，郭新光，劉 明, ，別小妹

（1.南京農業大學食品科技學院, 江蘇南京 210095；2.中國食品發酵工業研究院, 北京100015；3.食品行業生產力促進中心, 北京100015；4.全國食品發酵標準化中心, 北京100015；5.北京農學院食品科學與工程學院, 北京 102206）

納豆（Natto）是大豆等豆類經納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發酵而成的一類豆制品[1]，在1980年，芝加哥大學醫學院的日本研究員Hiroyuki Sumi通過實驗發現，納豆可以溶解人造纖維蛋白，1987年該團隊從納豆中提取到了一種溶解血栓的蛋白酶，并將這種新穎的纖溶酶命名為納豆激酶（Nattokinase，NK）[2]。NK 是一種絲氨酸蛋白酶，又稱枯草桿菌蛋白酶 NAT（EC 3.4.21.62）[3?4]，是典型的單鏈多肽酶，由275個氨基酸組成，分子量約為27 kDa，等電點在 8.6 左右[5]。

NK本質是一種蛋白質，主要是通過食用納豆進入人體發揮作用，在人體內會被分解成多肽和氨基酸等小分子物質，使NK無法完整的進入血液中，存在其溶栓活性降低或完全喪失的弊端，并且部分氨基酸會在微生物分解作用下產生氨氣及生物胺類物質從而使納豆散發出臭味，在感官上很難被消費者接受[6]，為了降低或者消除傳統發酵納豆的氨臭味，經冷凍、提取、濃縮、干燥等程序后制得凍干粉，后經加工工藝的優化和口味的改良，出現復合粉、糖果、膠囊、片劑等產品形式。NK溶栓效果是評價NK質量的核心指標，NK除了溶解血栓的主要功能外，還可以預防骨質疏松[7]、降血壓[8]、降血脂[9]、減脂助消化[10]、免疫調節[11]等。

目前對于產品中NK的質量評價主要體現在酶活力、酶穩定性及感官異味等，納豆發酵產生NK、維生素K2等多種活性物質的同時，還會代謝產生生物胺類物質，大量攝入會影響人體的生命健康。目前我國的納豆類產品及其形式多樣，加之尚未建立NK的技術規范、質量標準和相應的檢驗方法，因此，本文通過簡要綜述NK功能與溶栓機理、產品質量與安全評價研究進展，旨在為開發NK保健食品或溶栓藥品以及規范NK產品質量與安全評價方法提供理論依據。

1 質量評價

自1987年發現NK以來，國內外的科研工作者在其酶活力測定方法及酶活特性方面進行了深入詳盡的研究[12]，目前酶活力測定方法有瓊脂糖-纖維蛋白平板法、纖維蛋白溶解法、合成基質反映法、四肽底物法、Na-對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯法（TAME）、酪蛋白溶解法、纖維蛋白塊溶解時間法（CLT）、酶聯免疫吸附法（ELISA）等。NK溶栓功能作為評價其質量的核心指標，綜合近年來NK研究成果表明，NK溶栓功能的重點研究在體內外溶栓效果及機理發掘等內容上。隨著對NK特性、生理功能的深入研究，發現溫度、pH、激活劑和抑制劑是評價NK穩定性的重要方面，并且NK的攝入會經過消化道吸收作用于人體，因此，考察不同NK產品的酶學特性是未來評價NK產品質量的一大研究方向。

1.1 酶活力測定方法

瓊脂糖-纖維蛋白平板法是以纖維蛋白為底物測定NK活力的傳統方法，也是最早應用于NK溶栓活力檢測的方法之一，在國內實驗室和企業研究中應用較為廣泛，但該方法的準確度受實驗室操作者主觀及底物批次的影響較大，如果將量取平板溶解圈直徑的工具及底物統一化，將會大大提高準確性[13]。2009年“納豆之父”須見洋行博士提出了合成基質反應法，該方法以發色底物S-2251（H-D-Val-Leu-LyspNA）和 S-2444（pyro-Glu-Gly-Arg-pNA）作為測定NK活力的基質，在美國、歐盟等地區廣泛應用，但該方法使用的基質是最適合纖溶酶和尿激酶反應的底物，不能完全反映NK的活力值。紫外分光光度法是在合成基質反應法的基礎上發展起來的一種方法，被日本納豆激酶協會稱為纖維蛋白溶解法（http://jnattokinase.org/），相比于四肽底物法、TAME法、酪蛋白溶解法等其他方法，該方法選擇的纖維蛋白被認為是NK最合適的底物，解決了無法區分出真正的NK與其他相似酶的問題，測定NK活力準確性和精密度比其他方法要高，被認為是目前測定NK活力最合適的一種方法，日本最大的試劑制造廠商和光純藥（WAKO）已經采用該法來測定NK活力，并銷售NK標準品?；诂F有的國內外NK活力測定方法各有利弊的現狀，亟需結合不同測定方法對市場產品檢測的準確性差異進行優化改進，統一NK活力測定方法，更好的服務于NK類產品的質量評價。目前NK活力測定方法及檢測活力的準確性總結如表1。

表1 NK酶活力測定方法Table 1 NK enzyme activity determination method

1.2 NK溶栓功能與機理

1.2.1 溶栓功能 NK在體內外溶栓實驗中都表現出較強的纖溶活性，2008年，周伏忠等[16]提取純化實驗室的兩種NK，分別作用于自然凝固的新鮮兔血，20 h后觀察到兩種NK的血塊溶解率分別達到77.38%和85.08%。2003年，SUZUKI[17]采用光化學法致 Sprague Dawley（SD）大鼠（五周大，雄性）內皮損傷形成壁血栓，納豆提取物（NK）處理組血管壁血栓明顯溶解，大部分血栓從血管壁表面脫落，說明NK對由內皮損傷引起的血栓具有良好的溶解效果。2019年，GUO等[18]采用肌肉注射舒泰的方式麻醉SD大鼠（n=8，雌雄各半），分離大鼠的右頸動脈，將浸漬過三氯化鐵（FeCl3）的濾紙條覆蓋于暴露的大腦中動脈誘導血栓形成，注射NK，使用激光多普勒流量計監測血流量，結果發現NK基本阻止了血栓的形成。2020年，WU等[19]選取6周大昆明小鼠（雄性，18~22 g）建立二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型和脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠腎小球血栓模型，LPS觸發了氧化應激導致丙二醛（MDA）水平的升高，口服NK明顯抑制了血清纖溶酶原激活物抑制劑Ⅰ（PAI-1）水平，打破了炎癥、氧化應激和凝血之間的惡性循環，表明NK可以通過抗炎和抗氧化應激防止血栓形成的加速，為NK抗血栓機制提供了一種新型的見解。2009年，HSIA等[20]進行人體志愿者自身對照臨床試驗，將NK粗酶液凍干粉碎制成NK腸溶性膠囊（約200 mg/d），連續服用兩個月可顯著降低血清中幾種凝血因子的水平，包括纖維蛋白原、Ⅶ因子和Ⅷ因子。

以上的體內外以及人體試驗都證明了NK具有溶栓功能，和其它臨床使用的抗血栓酶類物質如尿激酶（Urokinase，UK）、鏈激酶（Streptokinase，SK）等相比，它表現出更強的溶栓效果，纖溶能力約是纖溶酶的4倍[21]，且成本較低、來源方便、無副作用、不容易引發出血等，能更好的改善血液流動，因此在預防和治療血栓類心腦血管疾病方面具有廣闊的發展前景，有望開發成抗血栓類藥物，投入臨床應用[22?23]。

1.2.2 溶栓機理 目前臨床上治療血栓類疾病的酶類藥物主要有 UK、SK、組織纖溶酶原激活劑（Tissue plamnipen activator，t-PA）等，NK 的溶栓作用類似于此類溶栓藥物，目前比較成熟的NK溶栓機理有四種（圖1）：a.NK的直接溶栓作用最早是FUJITA等[24]發現的，將純化后的NK和交聯纖維蛋白發生酶解反應，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）觀察，在降解產物中發現了 175、110、41、36、14.3 kDa等不同大小的片段，表明NK可以直接降解交聯纖維蛋白。b.NK激活血管內皮細胞，誘導產生t-PA，t-PA促使纖溶酶原轉化為纖溶酶，達到溶栓效果[25]。SUMI等[26]進行每天口服3次1.3 g NK腸溶膠囊人體志愿者試驗，從試驗對象的血液中提取并觀察血漿球蛋白的變化，結果表明，從口服NK的第一天開始，血液中的纖維蛋白降解產物就會顯著增加（P<0.05），還觀察到t-PA增加，印證了t-PA可以促進血栓的溶解。c.NK刺激血管內皮細胞產生t-PA，將尿激酶原轉化為UK，UK和t-PA一起激活纖溶酶原從而溶解血栓[27]。d.NK可以溶解PAI-Ⅰ，解除對t-PA的抑制作用，從而促進t-PA激活纖維蛋白酶溶解纖維蛋白，起到溶栓的效果。URANO等[28]將純化后的NK作用于重組原核PAI-1（Recombinant Prokaryotic PAI-1，rpPAI-1），用 SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析其蛋白水解作用，采用基質輔助激光解吸電離（MALDI）結合飛行時間（TOF）技術分別測定了完整和裂解形式的rpPAI-1的分子質量，結果表明rpPAI-1被裂解成更小的片段，NK使rpPAI-1在靠近其反應中心的位置裂解失活。

圖1 NK溶栓機理Fig.1 Thrombolytic mechanism of NK

1.3 NK酶活特性研究

影響NK穩定性的因素有很多，主要有溫度、pH、金屬離子等。

1.3.1 溫度 一般來講，每種酶的酶活力都會有最適溫度，溫度降低酶活力會變小，溫度過高會導致酶變性或失活，這主要和酶蛋白結構穩定性有關。李睿等[29]從本實驗室發酵納豆菌株中純化得到NKII，結果顯示47~ 60 ℃是NK的最適溫度范圍，55 ℃是發揮酶活的最適溫度。DEVI等[30]表示45 ℃是本實驗選取NK發揮最高酶活的溫度，加熱到70 ℃時，NK的強纖維蛋白溶解活性消失。肖美燕等[31]對NK反復凍融8次, 酶活力達到78%以上，在?20 ℃下保存7 d，酶活力基本不變。以上實驗結果表明，雖然不同來源、不同蛋白結構NK的最適溫度不一樣，但基本可以定論NK在低溫下穩定，在一定范圍內溫度越低酶活力損失越少，目前NK類產品的生產也主要是利用NK的這一特性，通過冷凍干燥的方式開發為凍干粉，進而加工成各種形式的產品，使其可以在人體溫度37 ℃穩定發揮作用。

1.3.2 pH pH會對酶活力產生影響，強酸強堿都會使酶變性或失活。中性和偏堿性環境下有利于NK酶活力的穩定，但在pH5.0以下極易失活。楊亞楠等[32]將純化得到的NK和不同pH（3.0~11.0）的緩沖液混合，分別測定不同pH下的NK酶活力，結果表明該酶在此操作環境下的最適pH為7.0。王愛萍等[33]模擬人體胃液、腸液中的生理過程，對NK粗酶液和固體粉末2種狀態的樣品進行纖溶活性研究，結果表明，粗酶液和固體粉末在人工胃液（pH1.8）處理5 h左右后, 活性分別下降了72%和65%,再用人工腸液處理5 h, 活性分別下降了11%和9%，說明2種狀態NK酶活力在人工胃液中大量損失，在人工腸液環境中較穩定。以上結果表明，NK在酸性和強堿性環境下不穩定，易失活，可以在中性或弱堿性條件下保存，保證NK酶活力的最大保留，為了避免NK類產品進入消化道后受到胃酸的破壞作用, 可以將其制成腸溶性的產品服用。

1.3.3 金屬離子 不同金屬離子對酶活力的影響存在差異，根據對酶活力產生的效果可以分為激活劑和抑制劑。Mg2+、Ca2+、Na+對于NK有明顯的激活作用, Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ba2+、Al3+、Mn2+對 NK 的活性表現出不同程度的抑制，高濃度的K+對NK活性有抑制作用。MOU等[34]采用光譜法考察金屬離子對NK活性和穩定性的影響，結果表明，化學計量比和高濃度的Cu2+、Co2+、Mn2+表現出不同程度的抑制作用，化學計量比的Tb3+和Ca2+對NK活性沒有影響，而高濃度的Tb3+和Ca2+則表現出一定的促進作用。綜合以上實驗結果，Ca2+、Na+、Mg2+對NK酶活力有一定的促進作用，同時是人體需要最多的金屬離子，可以將其加工成營養強化劑添加到NK類產品中，但要注意用量和非促進作用的金屬離子攝入。

2 安全評價

NK在保健食品領域具有廣闊的發展前景，全面掌握NK的毒理安全性對于開發NK溶栓藥物、保健產品至關重要。根據我國《保健食品安全性毒理學評價規范》，原料需進行急性經口毒性試驗、三項遺傳毒性試驗和28 d經口毒性試驗等毒理學評價研究。除了產品安全性評價，其生產菌的安全性也應該得到重點關注，依據《以酶制劑等為原料的保健食品評審規定》（衛法監發〔2002〕100號），使用微生物發酵直接生產保健食品的，需要提供菌種的毒力試驗報告和菌種的安全性評價報告。

2.1 NK的安全性

2.1.1 急性毒性研究 根據急性毒性實驗要求，超過人類推薦100倍劑量無毒副反應說明可安全食用。WU等[35]選擇六周大的昆明小鼠（18~22 g）進行NK急性毒性實驗，每組20只，雌雄各半，以NK的最大濃度 6000 Fu/mL和最大量 40 mL/（kg·BW）灌胃，單日兩次給藥，對組織器官進行肉眼觀察以及組織病理學評價，結果表明所有動物的體重都正常增加，未發現死亡或不良臨床體征或急性出血并發癥，未觀察到NK治療的毒性跡象，小鼠對NK的最大日耐受量高達480000 FU/kg。黃曉曼等[36]將酶活力為400 kU/kg的NK以最大濃度 10 kU/mL、最大給藥容量 40 mL/（kg·BW）一次灌胃給藥作用于NIH小鼠（18~22 g，雌雄各半），沒有發現任何不良反應。盡管已有的動物實驗研究證明在一定濃度范圍內飼喂NK不會產生急性毒性作用，仍然需要進行大量體內外實驗及人體流行病學調查來確保臨床應用的安全性。

2.1.2 三項遺傳毒性實驗 2019年，WU等[35]進行了NK的細菌反向突變（Ames）試驗、體外哺乳動物染色體畸變試驗和體內哺乳動物微核試驗三項遺傳毒性試驗。在Ames試驗中，使用NK（EsseZymeTM）不同濃度（0、0.5、1.0、2.5 和 5.0 mg/板）對推薦菌株TA97、TA98、TA100和 TA102處理后，NK對被測菌株回復突變菌落數均無顯著影響，因此，NK對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株均無致突變性。以六周大的昆明小鼠（18~22 g，n＝10，雌雄各半）進行體內微核試驗，連續四天以其最大每日耐受劑量240000 FU/（kg·BW）給藥，NK 處理組幾乎未觀察到任何微核。在體外染色體畸變試驗中，在任何濃度的NK下，具有結構和數字染色體畸變的CHL細胞數量均不超過所檢查細胞總數（每劑量水平200個細胞）的5%。本實驗所選用的NK（EsseZymeTM）在三項遺傳毒性試驗中均未檢測出遺傳毒性。

2.1.3 28 d經口毒性研究 付玉生等[37]將規格為0.4 g/粒的NK膠囊設低、中、高三個劑量組, 即1.0、2.0、4.0 g/（kg·BW）摻入飼料中投喂 SD 大鼠，劑量分別為人體推薦量的25、50、100 倍，結果表明試驗期間動物的活動、攝食、排便等一般狀況未見明顯異常，對大鼠體重、進食量和食物利用率、血液學檢查結果、血清生化檢驗結果、對臟器重量和臟器系數等的影響和對照組相比，無統計學意義，各組動物剖檢后肉眼觀察各臟器顏色、形狀、大小等均未見明顯病變。FUJI等[38]選擇SD大鼠進行28 d重復經口毒性研究，結果表明，大鼠的臨床體征無明顯變化，體重和食物消耗基本相等，進行肉眼檢查并確定器官重量，準備選定的器官和組織以進行組織病理學研究，最終確定未觀察到有害作用水平（No observed adverse effect level，NOAEL）為每天 167 mg/（kg·BW）。

2.1.4 90 d經口毒性研究 BOZO等[38]通過管飼法分別以 0、100、300 和 1000 mg/（kg·BW）的劑量施用于SD大鼠（每組12只，雌雄各半）90 d，每天進行臨床體征的檢查，最終未發現異常，這項研究的NOAEL 為每天 1000 mg/（kg·BW），這是目前 NK 90 d經口毒性試驗NOAEL的最高劑量。LAMPE等[39]使用NK產品NSK-SD（日本生物科學實驗室有限公司，日本，20000 FU/g）對SD大鼠進行的28 d經口和 90 d經口毒性研究，管飼劑量分別為167 mg/（kg·d）和 1000 mg/（kg·d），臨床及組織學病理研究都未觀察到不良反應。

2.1.5 消化和吸收 NK作為一種具有溶栓功能的營養物質，其健康保健功效備受關注，雖然已有諸多動物[40]以及人體實驗[41]證明口服NK后可以在腸胃道內檢測到不同分子量的片段，但其在腸胃道內具體是以何形式被吸收來發揮治療和預防作用鮮有研究。喬斌[42]通過在體外構建胃部與小腸模擬消化模型，復原人體的消化道環境，結果同王愛萍的實驗結果一致，NK作為堿性蛋白質，對胃酸幾乎沒有耐受性，而在腸道環境下，NK可以很好的保持其自身空間結果；使用人結腸癌細胞Caco-2構建體外小腸上皮細胞吸收模型，結果表明，NK只有達到一定濃度才可以以完整的蛋白質分子穿越小腸上皮細胞進入血液循環，進一步證實了NK可以開發成口服性腸溶膠囊產品。目前關于NK代謝的研究甚少，關于NK在人體內的代謝途徑及其機制研究是未來NK開發成保健食品或者溶栓藥品的熱點方向。

2.2 生產菌及其代謝產物的安全性

NK是由納豆芽孢桿菌發酵豆類過程中產生的一類活性物質，納豆芽孢桿菌屬于枯草芽孢桿菌亞種，發酵菌株的安全性、有害代謝產物、雜菌污染等因素直接影響其安全性，因此明確生產菌及其代謝產物的安全性至關重要。

2.2.1 致病性 致病性也稱為毒力，是指微生物感染宿主造成健康損害引起疾病的能力。YANAGISAWA等[43]將Meguro研究所（日本）提供的產品中提取到的納豆枯草芽孢桿菌以 50 mg/（kg·BW）和 200 mg/（kg·BW）注射于雄性 Wistar大鼠（8~9 周齡，250~300 g），結果表明其身體健康指標沒有明顯變化（不攝入、攝入50 mg/kg、攝入200 mg/kg納豆芽孢桿菌的優球蛋白溶解時間分別為(430±18)、(380±23)、(268±21) min）。HONG 等[44]對新西蘭白兔（3個月，雄性）灌胃1 mL純化的納豆菌孢子懸浮液（1×109/mL），進行 30 d重復毒性試驗，管飼 Dunkin Harley豚鼠（五周大，雌雄各半）納豆菌孢子懸浮液（1×1012/mL）進行14 d的毒性試驗，結果發現在試驗期間沒有死亡報告，也沒有觀察到生命體征或體重有任何明顯的變化，未觀察到所選內臟器官和組織的變化，對照組和實驗組血液學指標差異無統計學意義。

2.2.2 耐藥性 抗生素濫用使得生物體內細菌產生耐藥性甚至超級細菌，枯草芽孢桿菌可以抑制沙門氏菌、傷寒菌和痢疾菌等致病菌，在飼料行業作為益生菌取代抗生素發揮作用。但在食品行業，如果其存在可轉移耐藥基因，則有可能引起人體腸道細菌產生耐藥性。曾祥燕等[45]從納豆中篩選到四株納豆芽孢桿菌，采用藥敏紙片法測定其對阿散酸、土霉素、抗敵素等抗生素的耐受性，結果表明，四株菌株對這幾類抗生素都表現出不敏感。董超等[46]在納豆芽孢桿菌生長旺盛期加入常用的抗生素類藥物，觀察所引起的反應即耐藥性的大小，結果表明，納豆芽孢桿菌對酒石酸泰樂菌素、青霉素鉀、阿莫西林最為敏感，建議在使用阿莫西林等藥物時不要進食含納豆菌的產品。因為抗生素種類繁多，目前納豆芽孢桿菌耐藥性效果多采用表型檢測，缺乏耐藥基因研究，納豆菌與抗生素的相互作用效果以及食用過程中是否會產生耐藥性基因的轉移還需更深入細致的研究。

2.2.3 生物胺 近幾年有關生物胺的研究表明，在納豆發酵過程中會有生物胺類物質代謝產生，不但影響著產品的風味，還會帶來潛在的食品安全隱患，過量攝入會引發頭痛、惡心等一系列中毒癥狀[47]，因此控制和制定發酵納豆攝入水平至關重要。高澤鑫等[48]分離到一株高產NK的枯草芽孢桿菌GULR06，利用高效液相色譜法對發酵過程中的生物胺進行檢測，結果表明，尸胺、腐胺、2-苯乙胺、色胺、精胺、酪胺、亞精胺、組胺都能得到很好的分離，生物胺總量范圍在26.47~72.97 mg/kg之間，在人體可接受范圍內。目前未有納豆芽孢桿菌生物胺的代謝對人體產生危害的報道，工業上可以通過菌種篩選或組合發酵[49]來控制納豆過程中生物胺的代謝產生。

3 結語與展望

老齡化已經成為我國一個極為嚴峻的社會問題，以心血管疾病為主的老年群體常見疾病大幅增加，據大數據統計，2016年中國有近1億心血管病患者，1990~2016年，死于心腦血管病的人數從251萬增至397萬。雖然國家對于心血管疾病的投入力度加大、醫療技術進步，心血管疾病負擔顯著下降，但醫療福利覆蓋不全面，地區治療費用差異較高，老年病治愈率低，持續時間長。目前全球公眾衛生安全面臨著新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的威脅，現有研究表明，COVID-19病毒侵襲機體后，刺激血管內皮細胞致其損傷并誘導血管內彌漫性凝血，導致機體凝血功能紊亂[50?51]，老年人及有基礎疾病者感染后病情較重。因此，提高NK酶活力和穩定性，開發以NK為核心的保健食品，擴大其臨床和商業的應用符合《國民營養計劃（2017-2030）》“老年人群營養支持行動”和《中國防治慢性病中長期規劃（2017-2025年）》，將為改善老年人營養狀況、提高老年人群的整體健康水平提供重要的政策支撐和保障。

我國NK的質量評價主要依賴于酶活力高低的測定，評價指標過于單一。為使產品適用人體服用環境，高效長久保存，研究其在不同溫度、pH等影響因素下的穩定性，為完善NK質量評價方法提供理論基礎，更好的服務于NK類保健食品及溶栓藥品的開發。在我國納豆制品類標準《DBS 44/013-2019 廣東省食品安全地方標準 納豆粉》和《SB/T 10528-2009 中華人民共和國國內貿易行業標準 納豆》中，缺乏NK質量與安全評價的相關要求，因此需要盡快完善NK的統一行業標準，保證NK產品的質量安全，有利于我國以NK開發保健食品行業的健康長遠發展。