微小RNA在COPD發病機制中的研究進展

廖志文，周建榮

（1. 贛南醫學院2018級碩士研究生；2. 贛南醫學院第一附屬醫院呼吸內科，江西 贛州 341000）

慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是目前全球最常見的慢性疾病之一，2018 年我國COPD 患病人數超過了1 億，是導致衛生資源負擔增加和生活質量降低的重要原因［1-2］。環境與遺傳的相互作用是COPD發生的關鍵過程，而炎癥、氧化應激、蛋白酶與抗蛋白酶失衡被認為是重要的病理特征［3］。以往發現的重要環境因素如吸煙、職業環境暴露、大氣污染，能誘導肺結構細胞和免疫細胞功能異常［4］，這些異常的細胞共同參與了COPD的病理形成［5］。

微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一種長度為18～24 個核苷酸的非編碼RNA（Non-coding RNA，ncRNA），通過與mRNA的3′非翻譯區（3′untranslated region，3′UTR）結合，在轉錄后抑制靶mRNA 表達或促進mRNA 降解［6］。miRNA 種類豐富，每種miRNA可與多個不同的靶mRNA 結合，被認為控制著人類30%～60%的基因的表達，參與細胞增殖、分化、凋亡、癌變和免疫反應［7-8］。miRNA 可被外部環境誘導表達改變，這些miRNA 的改變引發肺結構細胞和免疫細胞功能失調，促成COPD 的病理改變。本文就miRNA在與COPD發病相關的細胞中的作用機制最新研究進展進行綜述。

1 MiRNA與氣道上皮細胞

氣道上皮細胞作為肺的保護屏障，通過粘液纖毛清除機制清除微生物和外來顆粒［9］。煙霧（Cigarette smoke，CS）或其他吸入刺激物可誘導氣道炎癥反應和上皮細胞的衰老、凋亡［4］。長期暴露于這些刺激下的人群和COPD 患者中肺內和血液中多種miRNA 表達水平發生改變，一些miRNA 被發現參與氣道上皮細胞功能調控，如miR-29b 參與炎癥因子的調控；miR-218、miR-146a、miR-181a-2-3p 調節炎癥激活通路；miR-126、miR-570-3p 與細胞衰老有關；miR-21、miR-145-5p 參與細胞凋亡。TANG等［10］研究發現，miR-29b 在吸煙者的肺組織、血漿中表達水平下調，而在COPD 患者中進一步降低，且與肺功能指標、白介素（Interleukin，IL）-8 水平相關。熒光素酶報告分析顯示，轉錄共調控因子BRD4（Bromodomain protein 4）基因是miR-29b 的調控靶點。體外香煙煙霧提取物（Cigarette smoke extract，CSE）處理的人支氣管上皮細胞（Human bronchial epithelial cells，HBEC）中miR-29b 同樣出現下調，導致BRD4 表達增加，進而增強下游的IL-8 基因轉錄。另外，抗氧化劑能防止CSE 誘導的這些改變，表明CS 可以通過氧化應激來誘導miRNA 表達改變。氧化應激直接損傷肺上皮細胞，同時引起DNA 損傷和細胞功能受損，加重細胞衰老、凋亡，增強炎癥反應［11］。PASCHALAKI 等［12］發現，與吸煙有關的miR-126 在COPD 患者的肺上皮細胞中表達降低，并在CS 暴露后的小鼠模型實驗中證明，下調的miR-126可以增強激活DNA 損傷通路的相關酶ATM（Ataxia telangiectasia mutated）蛋白激酶的活化，促進HBEC的衰老和功能障礙。Sirtuin-1 是一種衰老和炎癥的 重 要 調 節 因 子，與COPD 細 胞 衰 老 有 關［13］。miR-570-3p 在COPD 肺組織中表達增加，體外實驗顯示，miR-570-3p 同樣也可被氧化應激誘導表達上調，并通過直接抑制HBEC中sirtuin-1基因表達促進細胞衰老，增強炎癥因子的分泌，而miR-570-3p 拮抗劑能逆轉這些改變［14］。miR-570-3p 可能成為衰老治療的重要靶點。氣道上皮細胞增殖減緩和凋亡增加也是COPD 氣道中的重要特征，miR-21 被發現在CS 誘導的COPD 小鼠肺組織和CSE 處理后的HBEC 中表達上調，并參與了CS 誘導的HBEC 自噬和凋亡［15］。DANG等［16］發現吸煙者、COPD患者肺組織中miR-145-5p 的表達下調，進一步的體外實驗證實，miR-145-5p 可直接抑制介導細胞凋亡的相關基因KLF5（Kruppel-like 5）的表達，減輕CS 誘導的HBEC 凋亡和炎癥反應。然而，DUTTA 等［17］發現，miR-145-5p 在暴露于CS 后的小鼠肺組織中表達是上調的，并進一步證明，CS 通過轉化生長因子β（Transforming growth factorβ，TGF-β）誘導HBEC 中miR-145-5p表達的上調，并導致氣道粘液清除功能受損。這與DANG 等［16］研究中COPD 患者miR-145-5p表達下調的結果相反，兩者研究結果的不同在很大程度上取決于CS 暴露時間和強度。COPD 的發生是長期接受外界刺激的過程，這些miRNA 在隨病程延長而發生的改變可能反應了肺的代償機制。miRNA 在人類基因的調控網絡十分復雜，可能同時存在多種其他調控途徑。最近，SONG 等［18］在體外實驗利用雙熒光素酶報告分析證實，長ncRNA（Long noncoding RNA，lncRNA）母體表達基因3（Maternally expressed gene 3，MEG3）能與miR-218結合并調控miR-218 的表達，并共同參與CSE 誘導的網絡在調控氣道上皮細胞的功能上也具有重要的作用。在之前的研究中發現，miR-218 在COPD患者血清中表達下調，并且與吸煙有關，進一步的體外熒光素酶報告分析證實，HBEC 中可溶性腫瘤壞死因子受體（Tumor necrosis factor receptor，TNFR）1 的3′UTR 是miR-218 直 接結合靶點，miR-218 通過抑制HBEC 中TNFR1/NF-κB（NF-kappa B）信號的激活抑制CSE誘導的炎癥反應和粘蛋白MUC5AC高分泌［19］。miRNA 可能是氣道上皮抵御CS 誘導的炎癥激活的重要調節因子，而這些過程主要是通過調節NF-κB信號通路介導的。miR-146a、miR-181a-2-3p也被發現參與HBEC 中NF-κB 信號通路的調控，兩者分別被認為在亞微米顆粒物和金屬鎘誘導的炎癥反應中充當負反饋調節因子。LIU 等［20］在體外實驗發現，HBEC 中miR-146a被亞微米顆粒物通過激活NF-κB 信號通路誘導表達上調，并直接抑制NF-κB信號通路上游基因表達。KIM 等［21］利用全基因表達譜篩選出兩個與NF-κB 激活相關的基因，Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）4和SQSTM1/p62基因，被認為可能是miR-181a-2-3p潛在調控靶點。然而，與miR-181a-2-3p 不 同 的 是，miR-146a 無論 在COPD 患者還是體外亞微米顆粒物誘導的HBEC中表達均為上調［22］，miR-146a 的表達上調對COPD的炎癥的負反饋作用似乎是有利的，并且這種作用持續存在COPD 的發病過程中，而miR-181a-2-3p 表達被誘導下調，導致炎癥激活的相關基因表達增強，持續和不可逆的炎癥激活最終導致了COPD 持續的慢性炎癥反應。這表明一些具有類似生理功能的miRNA 被外界誘導表達改變時，造成的結果并不是都是同向的，而這種有利的miRNA 變化可能隨病程延長不足以抵抗失衡的miRNA 引起的不利改變，最終導致了不可逆的病理改變，這些過程可能反映了體內miRNA網絡的代償機制。

2 MiRNA與肺成纖維細胞

肺成纖維細胞（Lung fibroblasts，LF）主要作用是合成和維持細胞外基質，被認為是維持肺泡結構完整性的關鍵。CS 能干擾LF 的增殖和修復作用，抑制細胞外膠原凝膠收縮，而LF功能障礙是肺氣腫和小氣道纖維化發生的重要原因［23-24］。CS 誘導LF中的miRNA 失調，這些miRNA 參與LF的增殖、修復和細胞因子分泌調控等。ONG 等［25］通過在正常人的肺組織和LF 中進行RNA 測序發現，當前吸煙人群中miR-335-5p 的表達較過去吸煙和從不吸煙人群明顯下調，并用RT-qPCR 方法再次得到驗證，而3個與細胞增殖有關的基因，RB1、CARF和SGK3通過Argonaute 2 免疫沉淀法被鑒定是LF 中miR-335-5p的靶點。TGF-β 被認為是LF 增殖和修復功能重要調節因子。同一團隊［26］通過對TGF-β 刺激和未刺激的COPD 患者、健康者LF 中進行RNA 測序，發現了多種TGF-β 調節和與COPD 相關的miRNA，其中COPD 患者中miR-660-5p 較健康者表達顯著上調，miR-27a-5p經TGF-β誘導表達顯著上調，miR-21-5p、miR-148b-3p、miR-589-5p 和miR-376b-3p 在COPD患者中對TGF-β 的反應較健康者減弱，進一步用上述相同方法預測了miR-27a-5p、miR-148b-3p 和miR-660-5p 的多個靶點存在于與基因轉錄調控和細胞增殖相關的基因。TGF-β 介導調節的miRNA可能對LF功能調控具有重要作用，而TGF-β的異常釋放和LF 對TGF-β 刺激反應改變可能是造成COPD中LF功能障礙的重要機制。

低氧誘導因子1α（Hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）是調節缺氧反應的重要轉錄因子，在COPD的發生發展中發揮著重要作用。高表達的HIF-1α能誘導肺細胞凋亡，激活表皮生長因子受體/磷脂酰肌醇激酶/AKT 通路，上調炎癥因子的表達［27］。LIN等［28］發 現，miR-186 轉染后的LF 增殖 明 顯 減少，Western blot 分析結果顯示HIF-1α 蛋白水平降低，但仍高于陰性對照組水平，雙熒光素酶報告分析提示HIF-1α mRNA 的3′UTR 存在miR-186 的結合位點，這表明miR-186 可能調節HIF-1α 表達影響炎癥水平和LF 增殖功能，然而，miR-186 抑制劑轉染后的LF 增殖和HIF-1α 表達水平變化并不明顯，這可能是由于miR-186 在正常的LF 中的表達處于較低水平。LF 修復功能受多種方式調節，包括生長因子的釋放。血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是一種有效的血管生成和血管通透性調節因子，由HIF-1α 誘導表達，在COPD 的組織重塑和血管生成中發揮作用［29］。miR-503 在COPD 患者的LF 中的表達降低，體外實驗證實，miR-503 通過直接抑制VEGF mRNA 的表達，調節LF 的VEGF 的生成［30］。炎癥的限速酶環氧化酶-2（Cyclooxygenases-2，COX-2）是在miR-146a的調控靶點已被證實。ZHOU 等［31］研究發現，lncRNA PVT1可以誘導LF 中miR-146a 啟動子的甲基化，影響的miR-146a 加工和成熟，進而調控下游COX-2 基因的表達。另外，miR-146a 還參與HBEC 中炎癥反應的負反饋調節［20］。OSEI 等［32］發現，氣道上皮細胞來源的IL-1α增加LF中miR-146a-5p的表達，miR-146a-5p同時通過下調LF 中IL-1 受體相關激酶表達對氣道上皮源性的IL-1α 誘導的IL-8 分泌產生負調控作用，而COPD 患者LF 中miR-146a-5p 對IL-1α 的反應減弱而表達增加減少，IL-8 分泌受到的抑制作用減弱。

3 MiRNA與免疫細胞

COPD 的炎癥反應是多種細胞及炎癥因子參與的過程，除結構細胞外，參與的免疫細胞包括肺泡巨噬細胞（Alveolar macrophages，AM）、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞等，這些被激活的免疫細胞分泌多種炎癥介質、抗體、蛋白酶等對肺組織細胞產生細胞毒性；這種炎癥過程在隨后的長期的環境刺激下被持續激活和放大，并對COPD 的病理改變起著關鍵作用［5］。AM 位于肺上皮表面，經氧化應激激活后分泌多種趨化因子和細胞因子，在COPD的慢性炎癥中發揮關鍵的協調作用［5，33］。吸煙可以改變AM 中多種miRNA 的表達，其中一些miRNA 參與調節細胞分泌水平，如let-7c 通過抑制轉錄激活因子（Signal transducer and activator of transcription，STAT）3 的表達調節AM 炎癥因子釋放［34］。近期的研究發現AM 的激活和極化也與miRNA 有關，而NF-κB 相關通路中的基因常是其調控靶點。WANG等［35］發現miR-27-3p 在動物模型中表達上調，并進一步證明，miR-27-3p 通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-acfivated recep?torγ，PPARγ）的表達以增強AM 中的TLR2/4 信號傳導，進一步介導TLR2/4 信號下游的NF-κB、JNK/p38、JAK/STAT 通路，增強CS 和脂多糖誘導的炎癥反應，同時促進AM活化，影響AM的極化。miR-223也通過調控NF-κB 信號通路激活上皮細胞的炎癥反應，最近的研究還證明，miR-223 是中性粒細胞募集的重要調節因子［36］。中性粒細胞在COPD 患者的氣道中被募集和異常活化，并與疾病嚴重程度相關。這表明miR-223 在COPD 中的炎癥細胞網絡中可能充當著重要的角色。T 淋巴細胞在COPD 患者肺實質及氣道數目增加，與肺泡細胞破壞和凋亡密切相關［5］。DIAO 等［37］發現miR-132 在COPD 患者和吸煙者血清中的表達上調，與CD8+T 細胞數目比例相關，體外熒光素酶報告分析顯示，miR-132 可靶向結合轉導抑制因子5（Suppressor of cytokine signal?ing 5，SOCS5）mRNA 的3′UTR，而SOCS5 是淋巴細胞的發育和功能的重要調節因子，特別是CD4+T 細胞。SOCS5 基因表達減少可能引起CD4+T 數目的增殖減少，導致殺傷性CD8+T 細胞比例數上升，這可能是COPD 中肺泡細胞破壞和凋亡增加的重要原因。WEN 等［38］研究發現在COPD 患者和吸煙者外周血中miR-3202 表達下調，進一步的體外實驗顯示，CSE 誘導T 淋巴細胞中miR-3202 水平下調，共培養的HBEC 凋亡增加，而miR-3202 轉染的T 淋巴細胞可減輕這種反應。雙熒光素酶法證實，miR-3202 能通過直接抑制T 淋巴細胞中FAS 凋亡抑制分子2 基因的表達減弱T淋巴細胞的殺傷作用。

4 MiRNA與細胞交流

各種肺結構細胞群和免疫細胞亞群的協調功能構成了一個復雜的細胞間通訊網絡，這對肺部穩態和修復至關重要［39］。大多數前期關于COPD 中miRNA 的功能和作用的研究局限于特異種類的細胞內，而細胞間的聯系很少被提及（表1）。上述提及的miR-146a、miR-223分別被認為可能是COPD中異常HBEC 與LF、HBEC 與免疫細胞間串音的關鍵介質，這表明細胞外的miRNA 可能作為一種細胞通訊介質介導細胞網絡功能調控。細胞外囊泡（Extra?cellular vesicle，EV）是細胞旁分泌產生的膜性囊泡而存在于多種體液中，包括凋亡小體、微囊泡和外泌體，其作為細胞通訊的重要載體可以傳遞蛋白質、ncRNA、脂質、mRNA、DNA 等［40］。吸煙者和COPD 患者中多種EV-miRNA 的表達水平發生改變［41］。最近的研究證明，EV-miRNA 參與COPD 的發生和進展，并已成為當前的研究熱點。miRNA 的異常傳遞可能促進了原細胞中miRNA 的失調，而這種傳遞可發生同種或不同種細胞間，最終導致整條細胞網絡功能異常。GUPTA 等［42］研究發現，在氣道上皮細胞之間的EV-miRNA 和EV-粘蛋白MUC5B傳遞可以增加氣道分泌，促進氣道重塑的發生。HBEC-LF 異常通訊也是氣道重塑的重要因素，而miR-21 在上述HBEC、LF 中參與氣道修復和重塑過程［15，26］。XU 等［43］通過體外實驗發現，HBEC 來源的外泌體miR-21 可被CSE 誘導轉移到LF 中，并通過pVHL（Von Hippel-Lindau protein）/HIF-1α 信號通路促成肌成纖維細胞分化表型，同樣在CS誘導的小鼠模型上也得到驗證。另外，免疫細胞與肺上皮細胞間也可發生EV-miRNA 轉移。miR-223 可以經巨噬細胞或單核細胞微泡的分泌輸送到內皮細胞等非免疫細胞中［36］，可能充當肺部炎癥反應中重要的細胞間通訊介質。中性粒細胞胞外陷阱（Neutrophil extracellular traps，NETs）是由DNA 纖維和抗菌蛋白組成的細胞外網狀結構，不僅可抵御病原體侵入，同時也可介導宿主免疫損傷，與多種炎性疾病有關，包括COPD、哮喘等［44］。NETs 可以調節巨噬細胞和HBEC的炎性因子分泌，但對于這些過程機制目前尚不清楚［45］。最近有研究表明，NETs可能是細胞外miRNA的一種新的載體。LINHARESLACERDA等［46］研究發現，NETs 能攜帶miRNA-142-3p，并可以轉移到巨噬細胞中，調節TNF-α的產生。這表明NETs可能是通過攜帶miRNA 轉移到巨噬細胞和HBEC 中調控炎癥反應，但目前仍需要更多的研究來證實。

表1 COPD中差異性表達的miRNA的靶細胞、靶點及作用

5 總結和展望

COPD 的發生是環境和遺傳共同的結果，涉及多種細胞和細胞因子參與。近年來，大量miRNA 在這些細胞中作用機制被逐漸闡明，將進一步從環境與遺傳層面深入認識COPD的發生過程。miRNA作為COPD 生物標志物和治療靶點的潛力也越發突顯。但是，目前miRNA 在COPD 發病機制中的認識仍存在一定的局限性，miRNA 本身功能的高特異性和靶點的多樣性是重要原因。隨著miRNA 在參與COPD 發病的細胞內機制研究的不斷深入，以及細胞外miRNA 的聯系，特別是近年來EV-miRNA 與COPD 的研究，將更加全面的揭示COPD 發病中miRNA 的表觀調控機制，并且EV 作為miRNA 的載體可能為當前COPD 的miRNA 靶向治療研究提供一種更加精準的方式。