miR-375 靶向cyclin D2 調節口腔鱗癌細胞株增殖及凋亡的研究

方首镕 王曉云 蔣寧寧 孫立平

口腔鱗狀細胞癌簡稱口腔鱗癌，是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，癌細胞的增殖活力強、惡性程度高，治療后的復發率、轉移率均較高，5 年生存率不足50%[1，2]。目前，口腔鱗癌的發病機制未闡明，臨床上也缺乏靶向治療口腔鱗癌的手段。因此，研究口腔鱗癌的發病機制、尋找靶向癌細胞增殖的精確治療靶點具有十分重要意義。

微小RNA(microRNA，miR)是近年來發現的具有廣泛生物學作用的非編碼小分子RNA，多種miR 在惡性腫瘤發生發展的過程中通過靶向調節細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲來起到促癌或抑癌作用。miR-375 是一種具有抑癌作用的miR，在前列腺癌、食管癌、直腸癌、口腔鱗癌中的表達均明顯減少[3-6]，提示增加miR-375 表達可能是潛在的抗癌靶點。前列腺癌相關的細胞實驗證實，miR-375 對細胞周期蛋白D2(cyclinD2)的表達具有抑制作用[7]；在targetscan 網站進行生物信息學分析可知，cyclinD2 基因mRNA 的3’非翻譯區(3’UTR)中有miR-375 的結合靶點。基于此提出假設：miR-375能夠在口腔鱗癌中靶向cyclinD2 并調節細胞的惡性生物學特征。為了驗證這一假設，本實驗以口腔鱗癌細胞株CAL27 為實驗對象，具體分析了miR-375 靶向cyclin D2 調節細胞增殖及凋亡的作用。

1.材料與方法

1.1 細胞 口腔鱗癌細胞株CAL27(ATCC 公司，美國)，液氮中冷凍保存。

1.2 試劑 陰性對照(NC)mimic、miR-375 mimic、NC siRNA、cyclinD2 siRNA(上海吉瑪公司，中國)，表達cyclinD2 的pcDNA3.1 質粒及空白的pcDNA3.1 質粒(上海生工公司，中國)，miRNA 專用的提取分離試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒(北京天根公司，中國)，MTS 細胞增殖活力檢測試劑盒及Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒(北京全式金公司，中國)，cyclinD2 的單克隆一抗(Abcam 公司，美國)。

1.3 儀器 細胞培養箱(Thermo 公司，美國)，凝膠成像儀及熒光定量PCR 儀(Bio-rad 公司，美國)，顯微鏡(Olympus 公司，日本)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養及分組干預 CAL27 在含有10%胎牛血清的DMEM 中培養，0.25%的胰蛋白酶消化細胞并傳代，取傳代后對數生長期的細胞進行分組，方法如下：(1)對照組用不含脂質體的DMEM干預；(2)NC mimic 組用脂質體轉染NC mimic；(3)miR-375 mimic 組用脂質體轉染miR-375 mimic；(4)NC siRNA 組用脂質體轉染NC siRNA；(5)cyclinD2 用脂質體轉染cyclinD2 siRNA；(6)空白質粒+miR-375 mimic 組用脂質體轉染空白的pcDNA3.1 質粒及miR-375 mimic；(7)cyclinD2 質粒+miR-375 mimic 組用脂質體轉染表達cyclinD的pcDNA3.1 質粒及miR-375 mimic。每組設置5 個復孔，連續干預24 小時。

1.4.2 細胞增殖活力的檢測 傳代的CAL27細胞調節至細胞密度為3×104/ mL，按照每孔200μL 接種在96 孔培養板內并按1.4.1 的方法進行分組干預，24 小時后按照MTS 細胞增殖活力檢測試劑盒的說明書進行操作，檢測細胞在490nm波長處的細胞中，記錄為OD490，OD490 越高、細胞增殖活力越強。

1.4.3 細胞凋亡的檢測 傳代的CAL27 細胞調節至細胞密度為3×104/ mL，按照每孔500μL接種在24 孔培養板內并按1.4.1 的方法進行分組干預，24 小時后消化收集細胞，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒的說明書進行染色操作，染色后在流式細胞儀上計計算Annexin V 陽性且FITC陰性的細胞比例，即為凋亡率。

1.4.4 miR-375 表達的檢測 傳代的CAL27細胞接種在12 孔培養板內并按1.4.1 的方法進行分組干預，24 小時后棄去培養基、保留細胞，采用miRNA 專用的提取試劑盒提取細胞中的miRNA，采用cDNA 第一鏈合成試劑盒將細胞中的miRNA反轉錄為cDNA，用熒光定量PCR 檢測試劑盒對cDNA 中的miR-375 及U6 進行擴增，軟件中自動生成循環曲線及循環閾值(Ct)，根據Ct 計算miR-375 的表達水平。

1.4.5 cyclinD2 表達的檢測 傳代的CAL27細胞調節至細胞密度為3×104/ mL，按照每孔1.0mL 接種在12 孔培養板內并按1.4.1 的方法進行分組干預，24 小時后棄去培養基、保留細胞，用RIPA 裂解液提取細胞中的蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白含量，取含有30μg 蛋白的樣本進行western blot，將樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后電轉膜NC 后，將NC 膜放入5%脫脂牛奶中、室溫封閉1 小時，而后將NC 膜放入1∶1000 稀釋的cyclinD2 一抗或1∶5000 稀釋的β-actin 一抗中、4℃孵育過夜；第二天，將NC 膜放入1∶2000稀釋的HRP 二抗中、室溫孵育1 小時，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值、以β-actin 為內參計算cyclinD2 的表達水平。

1.2.6 miR-375 靶向cyclinD2 的生物信息學分析 在targetscan 數據庫中進行生物信息學分析，輸入miR-375 后得到靶基因列表，分析cyclinD2 基因mRNA 3’UTR 中與miR-375 結合的位點及堿基。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因檢測 構建包含cyclinD2 基因mRNA 3’UTR 的雙熒光素酶報告基因，先將雙熒光素酶報告基因用脂質體轉染進入細胞，而后按照NC mimic 組和miR-375 mimic組的干預方法分別用脂質體轉染NC mimic 或miR-375 mimic，24 小時后收集細胞并用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定螢火蟲熒光值和海腎熒光值，計算螢火蟲熒光值/ 海腎熒光值，以此反映雙熒光素酶報告基因的熒光活性。

1.2.8 統計學方法 采用SPSS23.0 軟件錄入數據，三組間計量資料的比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 過表達miR-375 對CAL27 細胞增殖及凋亡的影響 與對照組、NC mimic 組比較，miR-375 mimic 組細胞中miR-375 的表達水平及凋亡率均明顯增加，增殖活力OD490 水平明顯降低(P＜0.05)，見圖1。

2.2 過表達miR-375 對CAL27 細胞中cyclin D2 的靶向調節 經Targetscan 進行生物信息學預測，miR-375 能夠靶向cyclinD2 mRNA 3’UTR；與對照組、NC mimic 組比較，miR-375 mimic 組細胞中cyclinD2 的表達水平、熒光素酶報告基因的熒光活力明顯降低(P＜0.05)，見圖2。

圖1 三組間miR-375 表達、OD490 水平、凋亡率的比較

圖2 三組間cyclin D2 表達、熒光素酶報告基因活力的比較

2.3 敲低cyclinD2 對CAL27 細胞增殖及凋亡的影響 與對照組及NC siRNA 組比較，cyclinD2 siRNA 組細胞中cyclinD2 的表達水平及增殖活力OD490 水平明顯降低，凋亡率均明顯增加(P＜0.05)，見圖3。

2.4 過表達cyclinD2 對miR-375 調節CAL27細胞增殖及凋亡的影響 與空白質粒組比較，空白質粒+miR-375 mimic 組細胞中cyclinD2 的表達水平及增殖活力OD490 水平明顯降低，凋亡率均明顯增加(P＜0.05)，見圖4。

3.討論

癌細胞增殖及凋亡異常是口腔鱗癌重要的惡性生物學特征，研究口腔鱗癌細胞增殖及凋亡的調控機制有助于深入認識口腔鱗癌的發病機制。近年來，多種miR 被證實在惡性腫瘤的發生發展過程中起到促癌或抑癌作用，相應的在惡性腫瘤病灶中發生了高表達或低表達。miR-375 是在多種惡性腫瘤病灶中表達減少的一種具有抑癌作用的miR，多項細胞實驗證實，miR-375 對結直腸癌、膠質瘤、胃癌等惡性腫瘤細胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促進作用[8-10]。在口腔鱗癌患者的唾液中，miR-375 的表達明顯降低[6]，但miR-375 對口腔鱗癌細胞增殖及凋亡的調控作用及機制仍未闡明。因此，本實驗將以口腔鱗癌細胞CAL27 為對象、通過分析miR-375 對癌細胞增殖及凋亡的調控作用及機制來闡明miR-375 在口腔鱗癌發生發展中所起的作用。

圖3 三組間cyclinD2 表達、OD490 水平、凋亡率的比較

圖4 三組間cyclinD2 表達、OD490 水平、凋亡率的比較

在本實驗中，將miR-375 mimic 轉染進入CAL27 細胞后、細胞中miR-375 的表達明顯增多；在過表達miR-375 后，CAL27 細胞的增殖活力下降、凋亡率增加，說明miR-375 對CAL27 的增殖具有抑制作用、凋亡具有促進作用，這一生物學作用與miR-375 在口腔鱗癌患者唾液中表達降低的現象吻合。MiR 生物學作用的實現依賴與靶向結合靶基因mRNA 的3’UTR 后對基因表達的抑制，本實驗在targetscan 網站中對miR-375 進行了生物信息學分析并發現促增殖基因cyclinD2的3’UTR 上有miR-375 的結合靶點，轉染miR-375 mimic 后，CAL27 細胞中cyclinD2 的表達減少、含有CAL27 細胞基因3’UTR 的雙熒光素酶報告基因的熒光值明顯下降，說明cyclinD2 是miR-375 的靶基因，miR-375 靶向抑制cyclinD2的表達與其抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用有關。

CyclinD2 是調控細胞周期進程的蛋白，與細胞周期蛋白激酶形成復合體后能夠加速細胞周期，進而使細胞增殖活力增強、細胞凋亡受阻。多種因子被證實能夠通過改變cyclinD2 的表達來調節口腔鱗癌細胞的增殖及凋亡[11，12]。本實驗的結果已經證實miR-375 能夠靶向抑制cyclinD2 的表達，進一步通過轉染cyclinD2 siRNA 的方式來敲低cyclinD2 的表達并驗證CAL27 細胞中cyclinD2 表達下調的生物學效應。在敲低cyclinD2 的表達后，CAL27 細胞的增殖活力減弱、凋亡率增加，說明miR-375 引起的cyclinD2 表達減弱具有抑制增殖、促進凋亡的效應。為了進一步驗證miR-375 通過靶向cyclinD2 來調節CAL27 細胞的增殖和凋亡，本實驗還設計了過表達cyclinD2 的質粒，轉染質粒使細胞中的cyclinD2 發生過表達后，miR-375 抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用發生了逆轉，說明cyclinD2 表達減少介導了miR-375 抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用。

綜上所述，miR-375 對口腔鱗癌細胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促進作用且靶向抑制cyclinD2 是介導該作用的分子機制之一，未來miR-375 可以作為治療口腔鱗癌的靶點，但miR-375對口腔鱗癌的治療價值仍需進一步深入的研究。