貴陽地區15種常見嗜尸性蠅類的COI序列研究

楊水滔 馮 偉 洪小霞 楊 敏 蔣廷珍 黃 江 張紅玲 王啟燕

貴州醫科大學法醫學院 貴州 貴陽 550004

在法醫學死亡時間推斷中,研究表明建立在尸食性昆蟲基礎上的死亡時間推斷方法是目前較為有效的方法之一[1]。利用昆蟲生態群落組成、演替規律及生長發育規律等可為推斷死亡時間、死亡地點等提供信息[2-3]。在案件偵破過程中尸食性蠅類有著傳統法醫學無法比擬的優勢。本研究對貴陽地區常見的15種嗜尸性蠅類的mtDNA中COI348bp進行檢測,以探討其用于嗜尸性蠅類種屬鑒定的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蠅類樣本采集 蠅類樣本采集于貴州醫科大學解剖樓后樓,采集的樣本由貴州醫科大學法醫學院外聘教授陳祿仕教授參照《中國尸食性蠅類》[4]進行形態學分類鑒定。

2 方法

2.1 DNA提取 將樣本頭、雙翅、腹部及腿去除后取全部胸肌,按照離心柱式基因組DNA小量抽提試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)說明書提取DNA,并于-20℃保存備用。

2.2 PCR擴增

2.2.1 PCR擴增用引物 參照Sperling[5]報道所列引物進行設計。COI引物片段為C1-J-2495:5’-CAG CTA CTT TAT GAG CTT TAG G-3’;C1-N-2800:5’-CAT TTC AAG CTG TGT AAG CAT C-3’。引物由北京鼎國昌盛生物技術公司合成。

2.2.2 PCR擴增條件 利用ABI-9700型PCR(美國ABI公司)擴增儀對22個樣本分別擴增348bpCOI序列。PCR擴增體系總體積50μL,其中10×PCRBuffer(with Mg2+)5μL,dNTPmix(2.5mM each)4μL,上、下游引物(10μmol/L)各2μL,Taq 酶5U/μL0.25μL,DNA模板(1μL<1μg)1.5μL,ddH2O35.25μL。反應條件為94℃5min;92℃1min,48℃1min,72℃2min,共38次循環;72℃10min。

2.2.3 PCR擴增產物的電泳檢測及結果分析 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳(100V,30min),嗅化乙啶染色,紫外燈下觀察。

擴增產物序列測定由上海美吉生物醫藥科技有限公司ABI-3730遺傳分析儀測序。所有擴增產物均測雙向。

測序結果用DNAMAN4.0序列分析軟件進行序列拼接,NCBI中的BLAST進行序列比對及MEGA5.2軟件包中ClustalW進行序列校準,MEGA5.2軟件包中Kimura’s two-parameter模式分別分析尸食性蠅類mtDNA中COI348bp序列做進化距離分析,并構建系統發育樹。

3 結果

3.1 堿基組成差異分析 MEGA5.2軟件包對35個樣本的DNA序列數據分析堿基組成,得到COI基因保守位點204個,可變位點101個,簡約性信息位點95個,自裔位點6個,保守位點所占比例為66.45%,可變位點所占比例為32.90%。

3.2 距離法構建N-J系統發育樹 COI基因序列運用MEGA5.2軟件包中 Kimura’s two-parameter模式構建UPGMA系統發育樹,結果見圖1,從圖中可看出亮綠蠅、絲光綠蠅、大頭金蠅、宗緯別麻蠅、肥須亞麻蠅、廄腐蠅、叉麗蠅和巨尾阿麗蠅同一物種的不同樣本之間均按種聚類為一支,麗蠅科的金蠅屬的費曲靖與大頭金蠅聚為一支,裸金蠅屬的緋顏裸金蠅與金蠅屬又聚為一支,最后與綠蠅屬的聚為一大支;麻蠅科的別麻蠅屬中的棕尾別麻蠅和臺灣別麻蠅聚為一支,亞麻蠅屬的肥須亞麻蠅和野亞麻蠅聚為一支。橫帶花蠅和斑跖黑蠅單獨分支。構建的系統進化樹與形態學鑒定分類的結果一致。

圖1 COI基因序列構建的UPGMA進化樹Fig.1 COI gene DNA sequences build the NJ evolutionary tree

3.3 種內及種間進化分歧 表1是運用MEGA5.2軟件包中Kimura’s two-parameter模式對貴陽地區15種常見尸食性蠅類mtDNA上COI348bp基因序列進行分析后所建立的種內及種間進化分歧表,反應遺傳進化關系。

表1 COI基因序列進化分歧表Table1 the evolutionary divergence of the DNA sequences of COI gene

從上表可以看出,在COI348bp基因序列中種內進化分歧率范圍在0%-0.7%,最大種內進化分歧率出現在2個棕尾別麻蠅之間,為0.7%,最小種內進化分歧率出現在大頭金蠅之間、絲光綠蠅、亮綠蠅之間;種間進化分歧率范圍在3.0%-19.4%,最大種間進化分歧率出現在肥須亞麻蠅與廄腐蠅之間,為19.4%,最小種間進化分歧率出現在大頭金蠅和肥軀金蠅之間為3%(見表1)。

4 討論

用傳統形態學方法鑒定嗜尸性蠅類的種屬對人員要求較高,必須掌握昆蟲學相關專業知識,且具有豐富的實踐經驗,在我國僅有少數形態學專家具備這方面的能力[6],尤其是現場收集到的昆蟲學證據是蠅卵、幼蟲或蛹等時期時,目前尚無系統的形態學鑒別要點。要培養至成蟲進行種屬鑒定耗時較長。線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)具有嚴格遵循母系遺傳,避免雙親遺傳方式引起的隨機性;相對較高的堿基變化區,進化分歧率較高;基因組中不含間隔區和內含子,無重復序列、不等交換,在遺傳過程中不發生基因重組、倒位、易位等突變現象,而且與核DNA相比更容易提取和分離,對樣本保存條件的要求不高[7]等特點被廣泛應用。適合用來對不同發育歷期的尸食性昆蟲進行種類鑒定[8]。課題組前期研究結果顯示線粒體DNA中16SrDNA中保守位點所占比例86.1%,可變位點所占比例為13.4%,保守位點所占比例較高說明其進化速度較慢,大多數將其用于目水平上的系統發育和區系研究,少數用于科水平上的研究[9],本研究選擇mtDNA中可變位點相對占比例較高(COI保守位點所占比例為66.45%,可變位點32.90%)、進化速度較快、常被用于親緣關系較近的種、種下分類單元及地理種群之間的系統關系研究[10]的COI片段進行分析。

通過對貴陽地區15種嗜尸性蠅類的分析線粒體DNA的COI348bp序列分析,種間進化分歧率范圍在3.0%-19.4%,種內范圍在0%-0.7%,最大種內進化分歧率小于最小種間進化分歧率,沒有交叉重疊,因此可以用于嗜尸性蠅類種屬鑒定。且從遺傳距離、構建的系統進化樹的分析與形態學進行種屬鑒定的結果一致,該方法能將本研究中的15種嗜尸性蠅類進行較好的鑒別,可以作為形態學鑒定嗜尸性蠅類種屬的一個補充,對人員、實驗室要求均不高,經過培訓即可完成相應的工作,且該方法對現場昆蟲學的證據要求不高,蠅卵、幼蟲、蛹、甚至是成蟲的部分翅膀、足等均可作為提取DNA的檢材,因此利用推廣應用。由于嗜尸性蠅類種類繁多,后續將會繼續收集更多的嗜尸性蠅類進行驗證。