皮膚鱗狀細胞癌Nrf2和Keap1的表達分析＊

李雪麗 許雪珠 蘭建平 林妙春 王興斌 鄭雅男

鱗狀細胞癌（SCCs）為皮膚常見惡性腫瘤之一，好發于曝光部位，特別是顏面部，有一定損容性，易復發，病因不明，可能與長期紫外線照射、電離輻射等有關。核因子E2相關因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）與體內抗氧化反應密切有關，且對紫外線有防護作用。Keleh樣環氧氯丙烷相關蛋白 1（Keleh-like associated protein 1，Keap1）通過胞質內泛素化方式負性調節Nrf2的表達。病理狀態下，如氧化應激、親電壓力，Keap1作為一個分子傳感器，通過化學修飾使Nrf2與之解離[1-2]，Nrf2被釋放并快速轉移到細胞核內，與谷胱甘肽、谷胱甘肽S-轉移酶等氧化還原Ⅱ相代謝酶基因相關抗氧化反應元件（antioxidant response elements，ARE）結合誘導下游基因表達，參與體內氧化應激調節，降低細胞體內外氧化損傷。氧化損傷如不能及時修復，細胞可能發生癌變。現已有大量研究表明Nrf2與腫瘤發生、發展、轉移及腫瘤耐藥機制密切相關[3-5]。然而國內外對皮膚癌（包括鱗狀細胞癌）與Nrf2的關系研究較少，本文通過免疫組化技術分析Nrf2和Keap1蛋白在正常皮膚組織和皮膚鱗狀細胞癌中陽性表達情況，以期探討Nrf2在皮膚鱗狀細胞中的發病機制，從而為皮膚癌生物靶向治療提供理論依據，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

試驗組標本來自2013年9月-2015年1月在筆者所在醫院門診手術切除人顏面部皮膚鱗狀細胞癌組織，共15例，其中男9例，女6例，年齡56～81歲，平均（67.80±9.14）歲。納入標準：確診鱗狀細胞癌并行手術治療；既往未接受放化療、免疫學治療；標本留取完整并行病理學檢查；留取標本可進行Nrf2及Keap-1免疫組化檢查。排除標準：患者病歷資料不完整；伴有其他部位惡性腫瘤；伴有免疫系統疾病。對照組標本來自同例患者癌旁組織，并經病理學確診。本試驗于2013年9月-2015年8月在福建醫科大學附屬閩東醫院中心實驗室完成。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑如下：Nrf2和Keap1一抗[艾博抗（Abcam）（上海）貿易有限公司]、免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）等；主要儀器有：上海精宏電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9023A型）、武漢俊杰生物組織攤烤片機（JK-5型）、德國Leica石蠟切片機輛（RM2245型）等。

1.3 方法

本研究采用隨機對照試驗設計。免疫組化試驗：手術切除人顏面部病理學確診鱗狀細胞癌蠟塊及癌旁組織蠟塊，連續切片，厚度為5 μm，組織切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，自來水沖洗；石蠟切片脫蠟和水化后，自來水沖洗。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）水煮20 min進行組織抗原修復，PBS沖洗3次，3～5 min/次，除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗3次，3 min/次，除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl非免疫山羊血清，室溫下孵育10 min，直接甩去表層殘余血清，每張切片加50 μl的第一抗體，室溫下孵育60 min，PBS沖洗 3次，3～5 min/次，除去 PBS液，每張切片加 50 μl即用 型 MaxVisionTM（KIT-5910 MaxVisionTM HRP-Polymer antirabbit/mouse IHC Kit）試劑，室溫下孵育 15 min，PBS 沖洗 3 次，3 min/次，除去PBS液，每張切片加100 μl新鮮配制的DAB顯色液，作用5 min，顯微鏡下觀察。自來水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明后再中性樹膠封固。

1.4 觀察指標及評價標準

Keap1蛋白主要表達于細胞核和細胞質、Nrf2蛋白陽性著色表達于細胞核，兩種蛋白陽性染色呈黃色、棕黃色、褐色表達，陰性表達為淡藍色或深藍色的基礎染色，無黃色、棕黃色、褐色表達。觀察Nrf2和Keap1在鱗狀細胞癌和正常組織中的陽性表達率。

1.5 統計學處理

應用SPSS 15.0軟件對所得數據進行統計分析，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Keap1及Nrf2蛋白陽性表達情況比較

試驗組病例中皮膚鱗狀細胞癌共15例，所有患者術前檢查均未發現腫瘤轉移，均經手術治療，術后出現1例復發，其余在隨訪期間均無復發。免疫組化結果提示試驗組Nrf2及Keap1蛋白均有7例為弱陽性，占46.67%，對照組均為陽性；試驗組Keap1及Nrf2蛋白陽性表達率均低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 1。

表1 兩組Keap1及Nrf2蛋白陽性表達情況比較 例（%）

2.2 Keap1及Nrf2免疫組化結果分析

免疫組化結果：Keap1-對照組標本可見表皮中陽性表達，真皮中表達陰性（圖1A、B、C）；而試驗組即鱗狀細胞癌標本中，低分化標本（1例）、中-低分化標本（2例）、中分化標本（2例）、高-中分化標本（3例）表皮、真皮中Keap1表達均為陰性（圖1D、E、F），高分化標本（7例）表皮中表達部分為弱陽性，真皮中表達為陰性。Nrf2-對照組中表皮均為陽性表達，真皮表達陰性（圖1G、H、I），而試驗組即鱗狀細胞癌標本中，高分化標本（7例）表皮中可見少量弱陽性表達，真皮表達陰性，除高分化標本以外，表皮、真皮中Nrf2表達均為陰性（圖1J、K、L）。

圖1 鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中Keap1和Nrf2免疫組化表達結果

3 討論

根據本研究結果，筆者認為，與正常皮膚組織相比，Nrf2及Keap1在皮膚鱗狀細胞癌中陽性低表達或無表達，提示其可能與皮膚鱗狀細胞癌的發生有關，且腫瘤的分化程度也對其有一定的影響，高分化、惡性程度較低的腫瘤中可見Nrf2及Keap1弱陽性表達；分化程度低、惡性程度高的腫瘤中未見Nrf2及Keap1表達，說明Nrf2及Keap1表達下調與腫瘤的分化程度有關。

皮膚長期暴露于外界刺激（如紫外線、環境污染、毒素等）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和親電壓力，導致皮膚DNA和蛋白損傷，Nrf2可對抗這些細胞毒性作用，對疾病有化學保護作用。國內外許多研究表明Nrf2對腫瘤有抑制作用。比如說，Nrf2缺失小鼠更易發生致癌作用[6-7]，Nrf2丟失與癌癥轉移增加有關[8-9]。然而，新近研究表明Nrf2在惡性腫瘤（如胃癌、肺癌、腦膠質瘤等）細胞核中高表達并出現基因突變、丟失[10-13]。Nrf2通過上調ll相解毒酶、抗氧化蛋白等蛋白質的表達，從而改變體內的氧化還原狀態。在正常情況下，Keap1與Nrf2結合導致Nrf2降解；在氧化應激狀態下，Keap1蛋白不能泛素化降解Nrf2，Nrf2積累進入細胞核，與ARE結合，啟動一系列抗氧化基因和二相解毒酶基因的表達使得DNA、生物大分子免受損傷[14-15]。

當細胞受到氧化應激及高親電壓力時，Nrf2從細胞質解離，可通過Keap1依賴途徑及非Keap1依賴途徑進入細胞核內，但本文Keap1核內表達陰性，說明Nrf2可能是通過非Keap1依賴途徑進入細胞核內。盡管Nrf2在氧化應激方面有卓越作用，但亦可通過影響細胞內氧化還原系統平衡來參與細胞的增殖和分化，而染色體分析表明參與細胞增殖和分化的基因和氧化應激的基因并非完全一致，Nrf2多功能性提示Nrf2是一種誘導型的轉錄因子[16]。

本研究免疫組化結果示Nrf2在皮膚鱗狀細胞癌陽性表達減少或無表達，與Chang等[17]研究結果一致，與Stacy等[18]研究中頭頸部鱗狀細胞癌中91.5%伴有Nrf2高表達的結果相反。在本組病例中，分化程度高的鱗狀細胞癌標本中見到弱陽性表達的Nrf2及Keap1，而到高-中分化及其他分化程度低的標本中均未見陽性表達，考慮可能與皮膚長期紫外線等外界刺激、ROS聚集、親電壓力增加，導致Nrf2化學保護功能異常，同時影響負性調節因子Keap1過度降解Nrf2，導致Nrf2低表達或無表達，使其失去對腫瘤的抑制作用，且腫瘤的分化程度也對其有一定的影響，惡性程度高的腫瘤中未見Nrf2表達，說明Nrf2表達下調與腫瘤的發生有關。但具體機制仍未十分清晰，需要更多研究進一步明確Nrf2及Keap1在皮膚惡性腫瘤中的作用機制。盡管如此，Nrf2及Keap1在腫瘤靶向治療的研究中仍具有廣闊前景。