蛋白質組學技術在牦牛乳研究中的應用

馬靜，孫璐

1(青海大學 畜牧獸醫科學院，青海 西寧，810016) 2(青海高原牦牛研究中心，青海 西寧，810016)3(青海省高原放牧家畜動物營養與飼料科學重點實驗室，青海 西寧， 810016)

澳大利亞學者WILKINS等于1994年最早提出“蛋白質組(proteome)”的概念，蛋白質組學是闡明生物體基因組表達所有蛋白質的學科[1]。蛋白質組學技術補充了其他“組學”技術如基因組學和轉錄組學的不足，可闡明生物體蛋白質的身份以確定特定蛋白質的結構和功能，廣泛應用于鑒定和定量細胞、組織或生物體中的蛋白質[2]。生物體的蛋白質含量隨條件改變而變化，因此可采用蛋白質組學研究不同條件下蛋白質組成及變化規律的差異?？紤]到生物系統的復雜性，一般采用高效液相色譜法對蛋白質混合物進行分離，用質譜來實現蛋白質組的鑒定分析[3]。蛋白質組分析最常用的是“自下而上”的方法，即將蛋白質水解成肽，用質譜對肽段進行鑒定、定性表征和相對定量分析，最后通過生物信息學手段明確蛋白的結構和功能[4]。與高效液相色譜相比目前同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for rand absolute quantification,iTRAQ)技術在蛋白組學應用較多，iTRAQ技術是由AB Sciex公司開發的等壓標記技術，具有高通量，高穩定性且不受樣品性質的限制的優點，可以同時標記8個樣品的肽，并且可以獲得有關其修飾及數量的信息[5]。iTRAQ已廣泛應用于乳，微生物，動物，植物蛋白質翻譯后修飾的研究。鄧微等[6]為闡明牛初乳、牛常乳乳清蛋白的差異，利用iTRAQ 技術對兩者進行蛋白質組差異分析，在得到的599 種具有定量信息的乳清蛋白中，鑒定出60 種差異蛋白。孫玉雪[7]為了加深山羊乳與牛乳中的蛋白質尤其是一些低豐度蛋白質的了解，應用基于iTRAQ同位素標記的定量蛋白質組學技術對山羊乳與牛乳乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白進行了定量表征。iTRAQ技術在乳中廣泛應用明晰了多種哺乳動物的乳蛋白質譜，不僅為犢牛、羔羊早期斷奶提供了潛在指導，也為初乳、常乳乳品質的改善以及嬰幼兒奶粉和功能乳的開發提供了參考依據。

牦牛主要分布在喜馬拉雅山脈和青藏高原地區，適應了高海拔和極端的氣候條件，牦牛乳、肉是當地人主要的食物來源[8]。作為具有天然濃縮乳之稱的牦牛乳，含有蛋白質、脂質、糖、免疫細胞和生物活性分子，可為機體提供營養，并具有抗炎和抗感染的功能。在安全性上，牦牛乳特有的蛋白質比普通牛乳蛋白的致敏性更低[9]。且牦牛乳中的總固形物(16.9%～17.9%)、蛋白質(4.9%～5.9%)和脂肪(5.5%～7.5%)的含量均高于普通牛乳，營養價值高，易消化吸收。此外，牦牛乳脂肪酸中的共軛亞油酸(conjugated linoleic acid, CLA)較普通牛乳含量更高[10]。目前，已有實驗模型證明CLA有利于降低人體脂肪水平、血糖水平、動脈粥樣硬化及癌癥風險，CLA能調節免疫功能，有助于糖原的重新合成并增強骨骼礦化作用，補充CLA可增加脂肪分解作用并減少脂肪酸在脂肪組織上的積累[11]。乳作為嬰兒營養的首選來源，其蛋白質和游離肽為嬰兒生長提供部分必需氨基酸和非必需氨基酸，另外有充分的證據表明，隨著嬰兒生長發育的成熟，母乳有助于建立嬰兒的先天性和適應性免疫反應[12-13]。蛋白組學技術的應用可以明晰乳中特征蛋白質與差異蛋白質，為嬰幼兒配方乳粉細化和功能化配比研究提供理論依據。本文闡述了蛋白質組學技術在牦牛乳中的應用和牦牛乳蛋白質的組成，為牦牛乳功能成分的進一步研究提供理論基礎。

1 蛋白質組學技術研究進展

1.1 樣品保存

蛋白質組學技術可以同時鑒定和檢測多個差異蛋白，是一門相對發展較快且較新的學科[14]。利用蛋白質組學技術對乳蛋白的組成進行分析之前，首先需要明確樣品的保存方式，不同的保存方式會引起牛乳蛋白組表征結果的偏差[15]。一般牛乳的貯藏方式有兩種，一種是加入防腐劑(如溴硝酚、重鉻酸鉀等)，分析前在4～8 ℃的振蕩器上輕輕混合24 h。另一種是浸入液氮中快速冷凍，然后轉移到-80 ℃的冰箱中保存[16]。一般使用基于溴硝酚的防腐劑在檢測分析過程中會引起系統誤差，對蛋白質結果測定影響最大，建議該情況下使用校正因子進行校正。

1.2 蛋白分離

1.2.1 高豐度蛋白質分離技術

乳中的高豐度蛋白質主要為酪蛋白(casein, CN)，主要分為α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)、κ-酪蛋白(κ-CN)[17]。LI等[18]為了比較不同品種水牛乳的蛋白質含量、組成和差異，通過反相高效液相色譜測定水牛乳的蛋白質組成。并通過二維凝膠電泳-質譜聯用對不同品種水牛乳的蛋白質進行表征。二維凝膠電泳該技術將第一維的反相高效液相色譜與第二維的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)耦合，同時結合具有高分辨率功能與靈敏度和高質量精度的質譜，可更好地闡明復雜生物樣品中蛋白質的同工型[19-20]。

1.2.2 低豐度蛋白質分離技術

低豐度蛋白在牛乳中所占比例較少，但具有重要的生物學功能。牛乳中低豐度蛋白質有乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白，乳鐵蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，肽激素和酶等[21]。在低豐度蛋白分離過程中，高豐度蛋白會覆蓋低豐度蛋白，并妨礙其檢測的敏感性，需提前去除高豐度蛋白質，如何去高豐度蛋白十分重要。靳登鵬等[22]以1 月份左右的成熟乳為試驗材料，先通過免疫親和層析和ProteoMiner 低豐度蛋白富集試劑盒2種前處理方法去除高豐度蛋白，對母乳乳清蛋白組學進行了分析。免疫親和層析(immunoaffinity chromatograph, IAFC)是以抗原或抗體中的一方作為配基親和吸附另一方的分離方法。具有特異性目標蛋白的抗體與惰性微株共價結合，產生免疫吸附活性，然后將復雜的蛋白質混合物通過免疫吸附捕獲目標蛋白質，而其他非目標蛋白質則在色譜柱中被沖走[23]。此外，離心也是獲得低豐度蛋白質的主要途徑。NISSEN等[24]在二維液相-二級質譜聯用分析之前對乳樣進行預分級分離，通過高速離心獲得乳清，離心可有效提高低豐度蛋白的檢測。

1.3 乳蛋白鑒定及定量

乳蛋白的鑒定及定量一般通過蛋白質組學分析完成，與酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)相比具有顯著優勢，蛋白質組學利用液相色譜和質譜來分離、鑒定和表征蛋白質，而不依賴抗體[25]。其中質譜分析是蛋白質研究的主要技術手段。質譜不僅可以測量多肽的分子質量，還可以確定氨基酸序列或連接位點和翻譯后修飾的類型[26]。如今對鑒定、表征和定量蛋白質的靈敏度和準確性的要求越來越高，因此各種基于質譜的新型分析平臺和實驗方法顯得尤為重要。

1.4 蛋白質組學生物信息學分析方法

蛋白質組學所包含的生物信息學分析內容有基因本體(gene ontology，GO)分析、京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析、聚類分析、蛋白互作分析等。并結合特定的算法，根據蛋白質或蛋白質酶解物肽段的分子質量與蛋白質數據庫進行比對，從而鑒定出樣品中的蛋白質種類[27]。

2 牦牛乳蛋白質組成及特性

2.1 牦牛乳酪蛋白組成及特性

牛乳蛋白主要包括為酪蛋白、乳清蛋白(whey protein, LA)和脂肪球膜蛋白。其中80%是酪蛋白，包括αS1-CN，αS2-CN，β-CN和κ-CN 4種。酪蛋白是由位于6號染色體上的4個基因(CSN1S1，CSN1S2，CSN2和CSN3)編碼并且編碼區突變率較高[28]。牛乳中不同類型的酪蛋白因結構相似，能夠自行結合形成聚集體，并與膠體磷酸鈣形成膠束結構[29]，是實現酪蛋白功能的關鍵。CN是鈣、磷和氨基酸的關鍵營養來源，滿足哺乳動物新生嬰兒的生長和能量需求[30]。牛乳中CN水解生成酪蛋白磷酸鹽或肽類還可被廣泛用于食品、制藥行業[31]。CN衍生的許多肽具有不同的生理功能，被稱為“生物活性肽”，這些肽可通過體內消化釋放，也可通過酶促水解反應在體外釋放[32]。β-CN衍生形成短鏈的蛋白質水解肽為阿片肽，與機體消化調節、營養物質的攝取、免疫調節和抵抗病原菌等有關[33]。κ-CN經胰蛋白酶水解后，生成Casopiastrin肽，它能夠阻止纖維蛋白原與血小板結合，表現出抗血栓活性[34]。CN磷酸肽可以形成可溶性有機磷酸酯鹽，充當不同礦物質(尤其是鈣)的載體，具有細胞調節作用[35]。牦牛乳為CN性乳類，其含量較奶牛乳、駱駝乳、羊乳、水牛乳、驢乳、人乳相比最高，而且牦牛乳中κ-CN, αS2-CN, β-CN、β-乳球蛋白、鈣和磷的含量顯著高于荷斯坦牛乳，也是2種乳源酸化過程中表現出結構和性質差異的原因[36-37]。牦牛乳中CN具有良好的乳化性、溶解性和熱穩定性，適用于食品添加劑廣泛應用于食品工業中。但是，嬰兒對CN的吸收率較低，牦牛乳CN與人乳相比含量過高不利于嬰兒的消化吸收。在中國營養學會2019婦幼營養學術年會中來自荷蘭瓦赫寧根大學乳品科學和技術學科教授、弗里斯蘭坎皮納大學首席科學家、維多利亞大學客座教授和國際乳品雜志主編THOM HUPPERTZ教授分享了有關CN礦化對嬰幼兒消化吸收影響的新發現。當CN礦化水平較低時，其在胃內形成較小且松軟的凝乳顆粒，而這些凝乳顆粒會比礦化水平高的CN形成的顆粒更容易被分解，而關于牦牛乳CN的礦化水平目前未見相關報道。

2.2 牦牛乳清蛋白組成及特性

LA是球形蛋白，被認為是一種快速的蛋白質，與CN相比，它可以快速到達空腸，水解速度較快[38]。LA包括β-乳球蛋白,α-乳白蛋白,免疫球蛋白,血清白蛋白以及乳鐵蛋白和乳過氧化物酶等，占牛乳蛋白質的18%～20%[39]。乳清蛋白被認為是高品質的蛋白質，具有吸收率較高而脂肪、乳糖和糖類含量較低的生理特點同時含有豐富的支鏈氨基酸和生物活性多肽，具備了有益于人體的多種保健功能[40]。通常被用作膳食蛋白質的營養補充劑，可以參與免疫調節、改善肌肉強度和身體組成，并防止心血管疾病和骨質疏松癥。乳清蛋白中含有的氨基酸和生物活性肽，在消化分解后會迅速吸收到循環系統中，有益于Ⅱ型糖尿病患者餐后血糖的改善。乳清蛋白直接刺激胰腺β細胞分泌，并通過腸降血糖素效應增加胰高血糖素樣肽1和抑胃肽的分泌，使餐后血糖發生還原從而降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖濃度。當乳清蛋白酶促水解時所產生的衍生物由于營養上的氨基酸組成及低致敏性而被添加于兒童食品。含乳清蛋白的食物具有抗焦慮作用，可降低大鼠血壓，預防腹瀉等[41-43]。牦牛乳中乳清蛋白的比例與普通奶牛乳、山羊乳及水牛乳相似約為8∶2，牦牛乳清蛋白中致敏性β-乳球蛋白的含量是普通牛乳的1/5，以牦牛乳為嬰幼兒奶粉，即避免了除致敏性蛋白的過程，還降低了牦牛乳營養成分的破壞，最大限度保留牦牛乳營養[44]。牦牛乳低致敏性和高消化率的特征更適合嬰兒和特殊需求人群食用，是一種珍貴的乳品資源。

2.3 牦牛乳脂肪球膜蛋白組成及特性

乳脂肪球膜(milk fat globule membrane, MFGM)蛋白占乳蛋白的1%～4 %，是一個復雜的構建體，由蛋白質和脂質組成的3層膜，其內單層來源于乳腺細胞的內質網，外雙層則來源于泌乳的乳腺的上皮細胞的頂膜，MFGM包括膽固醇，甘油磷脂，鞘脂和蛋白質[45]。其中以高濃度存在的蛋白質包括黏蛋白1、黃嘌呤氧化還原酶、酪氨酸、乳黏附素、CD 36、脂肪蛋白和脂肪酸結合蛋白[46]。乳脂肪球膜蛋白的結構和具有生物活性的成分不僅可以在嬰兒生長和免疫調節過程中提供必需的營養物質，而且可以通過調節各種代謝來幫助嬰兒腸道的結構和功能成熟。乳脂肪球膜蛋白周圍的抗菌肽和表面碳水化合物可能對腸道微生物種群的建立至關重要，與機體早期免疫和抵抗炎癥有關[47]。此外，LI等[48]通過GO富集和KEGG途徑發現乳脂肪球膜蛋白與胞吞作用，生熱作用，阿爾茨海默氏病，癌癥和人乳頭瘤病毒感染密切相關。乳脂肪球膜蛋白質在牦牛乳中與牛乳、山羊乳、水牛乳、駱駝乳相比所占比例最高[49]。LUO等[50]發現在牦牛乳脂肪球膜內存在不規則脂質結構域，而造成這一特殊脂質結構域的原因是高含量的鞘磷脂(sphingomyelin, SM)，高含量的SM有益于機體的新城代謝和消化系統健康，且牦牛乳的乳脂肪球比普通牛乳更大，在加工過程中更易于聚集，是制造黃油和酥油產品的理想來源[51]。牦牛乳作為獨特的、高營養價值功能型保健食品，是機體生理機能調節及功能性食品開發的理想乳品資源。

3 蛋白質組學技術在牦牛乳研究中的應用

3.1 蛋白質組學在牦牛乳脂肪球膜中的應用

隨著蛋白質組學技術在牦牛乳脂肪球膜中的廣泛應用，其含量和結構也逐漸清晰地呈現在人們面前。為研究牦牛奶脂肪球膜的組成及其蛋白的熱穩定性，何勝華等[52]用物理方法提取分離了牦牛乳中的乳脂肪球膜蛋白質并將洗滌前后的牦牛乳脂肪球膜進行SDS-PAGE分析，結果顯示牦牛MFGM主要由蛋白質(26.93%)和脂類(70.34%)兩大物質組成，還含有少量的己糖、唾液酸和灰分，其蛋白的主要氨基酸是谷氨酸、亮氨酸、絲氨酸和賴氨酸，其中必需氨基酸占整個氨基酸的49.48%；當溫度升高至60 ℃ 的時候發現牦牛乳脂肪球膜蛋白發生變化屬于熱不穩定蛋白。JI等[53]通過相對定量和絕對定量蛋白質組學的方法在牦牛乳和普通牛乳之間共鑒定出450多種MFGM差異蛋白，通過比較差異蛋白相對豐度，發現糖基化依賴性細胞黏附分子1、CD59分子和乳黏附素等蛋白質在牦牛MFGM中的豐度要高得多(4.6～10.1倍)，比普通牛乳MFGM高得多。蛋白的生物學功能的GO富集分析結果表明，牦牛MFGM蛋白的主要分子功能與普通牛乳之間幾乎沒有差異。牦牛乳乳脂肪球膜蛋白為熱不穩定蛋白，其結構與組成與普通牛乳存在差異，但兩者主要的分子功能相似。目前人乳和普通牛乳的乳脂肪球膜蛋白組學被廣泛研究，但牦牛乳脂肪膜蛋白潛在的生物活性與牦牛乳脂肪球膜各組成成分與其微結構之間的關系有待深入研究。

3.2 蛋白質組學技術在牦牛乳清蛋白中的應用

蛋白質組學技術在牦牛乳清蛋白中的應用大多都集中在對于牦牛乳清蛋白熱變形機制和熱凝聚作用的研究。王立楓等[54]在2017年通過使用體積排阻色譜法檢測不同的加熱溫度和加熱時間對牦牛乳清蛋白形態及質量分數變化的影響。結果表明，當加熱溫度高于β-乳球蛋白的變性溫度會導致蛋白發生聚合，加熱溫度在牦牛乳清蛋白聚合中占據主導地位。YANG等[55]利用iTRAQ標記的蛋白質組學技術比較牦牛初乳和常乳中乳清的蛋白質譜。在牦牛乳清中鑒定出183種蛋白質；初乳和常乳乳清之間有86種蛋白的表達水平顯著不同，其中血紅蛋白的表達水平在初乳乳清中顯著高于常乳乳清；許多差異表達的蛋白質與生物學調節和對刺激的反應有關。此外，一些研究闡述了牦牛乳清蛋白濃縮物的組成特點和功能性質。白莉莉[56]分析了牦牛乳清粉和牦牛乳清蛋白濃縮物的溶解性、持水性、持油性、起泡性、乳化性和熱穩定性等功能性質并通過SDS-PAGE 鑒定了牦牛乳清粉和牦牛乳清蛋白濃縮物的乳清蛋白組成成分。對不同牦牛乳清蛋白的綜合鑒定，可為嬰幼兒奶粉的改良提供基礎信息。

3.3 蛋白質組學技術在牦牛酪蛋白中的應用

由于牦牛乳酪蛋白膠束的凝乳特性及CN衍生肽的多種功能，現如今大多研究集中在通過蛋白質組學技術了解牦牛乳酪蛋白膠束及其生物活性肽。宋禮等[57]研究了胰蛋白酶制備牦牛乳酪蛋白降血壓肽的最佳水解條件和分離純化工藝，通過單因素、正交實驗，確定了最佳水解條件并通過液相色譜及質譜檢測，得到牦牛乳酪蛋白降血壓肽的序列片段為HQGLPQEVLNENLLR、AVPYPQR和TKVIPYVR。王鵬杰[58]通過超速離心分離出牦牛乳酪蛋白膠束，用高效液相色譜測定膠束中蛋白的組成，發現牦牛乳酪蛋白膠束的理化性質與荷斯坦牛乳存在較大差異，對于己經成熟的荷斯坦牛乳的單元操作，不能直接地應用于牦牛乳。董愛軍等[59]同樣利用高效液相色譜準確分離定量了牦牛乳中的CN除α同乳白蛋白外，麥洼牦牛乳中αs-CN、β-CN、κ-CN、β-乳球蛋白、血清蛋白的含量均高于牛乳。因此牦牛乳具有很高的營養價值和開發利用價值。對與蛋白質組學技術在牦牛乳酪蛋白中應用，HPLC技術的使用廣泛，而iTRAQ 技術的應用較為少見。iTRAQ 技術在牦牛酪蛋白中的使用可能更有利于嬰兒配方乳中主要乳蛋白的精確表征和定量。

4 展望

隨著蛋白質組學技術在牦牛乳中的廣泛應用，使得鑒定和表征牦牛乳中主要蛋白質，蛋白質衍生物及最終產品更加準確高效。在公共安全領域，利用蛋白組學可以準確、快速、可靠地診斷食物過敏，尤其是牛奶過敏，由此避免嚴重的過敏反應。對于潛在的生物標志方面，乳蛋白組學成就也十分突出。蛋白質組學技術有助于闡釋牦牛乳蛋白各個組分的功能，為充分利用牦牛乳資源,為嬰幼兒提供理想營養奶粉提供基礎。