轉(zhuǎn)化虎杖苷虎杖內(nèi)生真菌的分離及鑒定

于潔，徐勤茜，李子院，劉紅艷，郝再彬，李海云

(桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西高校食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林，541004)

虎杖為多年生草本植物，是一種常用的中藥，主要活性成分是虎杖苷、白藜蘆醇和蒽醌類化合物[1]。白藜蘆醇是虎杖的次生代謝產(chǎn)物，具有抑制腫瘤、抗癌、保護(hù)心血管、抗氧化、抗炎癥、調(diào)節(jié)自身免疫力、保護(hù)肝臟等作用[2-6]。目前白藜蘆醇的制備方法主要有溶劑提取法、化學(xué)合成、生物合成以及微生物轉(zhuǎn)化法[7-9]。從植物中采用溶劑法直接提取分離白藜蘆醇，是目前天然白藜蘆醇最主要的生產(chǎn)方法，但植物中的白藜蘆醇含量低，限制了應(yīng)用；化學(xué)合成方法步驟復(fù)雜、經(jīng)濟(jì)損耗高且存在污染等問題[10-11]；生物合成法環(huán)境污染小，資源破壞少，具有較大的應(yīng)用價(jià)值，但是如何實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)還是一個(gè)急需解決的問題[12]。相對(duì)而言，微生物轉(zhuǎn)化法具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可以克服其他方法的弊端。虎杖中白藜蘆醇含量較低，但虎杖苷含量較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)2.55%。因而利用微生物轉(zhuǎn)化虎杖苷是制備白藜蘆醇的可行途徑之一。目前關(guān)于微生物轉(zhuǎn)化虎杖苷合成白藜蘆醇的研究報(bào)道已有不少[13-20]，但總體而言，高活性的菌株數(shù)量不夠多，尋找新的高效轉(zhuǎn)化微生物菌源仍是重點(diǎn)研究方向。植物內(nèi)生菌是一類生活在健康植物組織內(nèi)部的，不引起宿主植物出現(xiàn)明顯病害癥狀的一類微生物，近年來在生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的應(yīng)用受到重視[21-22]。例如，劉華金等[23]從虎杖根、莖中分離出6株內(nèi)生真菌，其中的草酸青霉具有轉(zhuǎn)化虎杖苷為白藜蘆醇的能力，最高轉(zhuǎn)化率為25.6%。本文擬從廣西產(chǎn)的新鮮虎杖中分離篩選高效轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的內(nèi)生真菌，為微生物轉(zhuǎn)化制備白藜蘆醇的產(chǎn)業(yè)化提供潛在的微生物資源及技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物材料：2年生新鮮虎杖，2018年10月采摘于南寧藥用植物園。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：NaNO32，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO40.5，F(xiàn)eSO40.01，虎杖苷10，瓊脂20，pH自然。

復(fù)篩培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth,PDB)。

虎杖苷，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；白藜蘆醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)，引物ITS2(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，真菌DNA提取試劑盒，上海生工生物工程有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑，所用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱(LRH-150-Z),珠江韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(BXM-30R)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺(tái)(CJ-1SFS)，天津市泰斯特儀器有限公司；高效液相色譜儀(Aglient1260LC)，安捷倫科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀(2720-Thermal-Cycler)，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；電泳儀(JY5000)，北京君意東方電泳器有限公司；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1600),上海天能科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的初篩

將采摘回來的新鮮虎杖，用自來水清洗干凈后，從中選取表面健康無病害的新鮮虎杖，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精浸泡1 min，再用25 g/L次氯酸鈉溶液浸泡20 min，最后用無菌水沖洗6次，以清洗去除附著在虎杖表面的消毒液。經(jīng)表面消毒的虎杖采用漂洗液檢驗(yàn)法[24]和組織印跡法[25]進(jìn)行表面滅菌效果的檢驗(yàn)。在無菌條件下將經(jīng)表面消毒的虎杖進(jìn)行粉碎后，置于培養(yǎng)皿中，加適量無菌水使其潤(rùn)濕，然后置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，自然固態(tài)發(fā)酵7 d。取固態(tài)發(fā)酵粉末適量，用無菌水[1∶10(g∶mL)]制成懸浮液并靜置30 min后，取200 μL上清液涂布于以虎杖苷為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的霉菌頂端菌絲，轉(zhuǎn)接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)固體培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)成后，不斷重復(fù)先前的步驟直至獲得純培養(yǎng)物。純化后的菌株編號(hào)后分別接種至PDA斜面培養(yǎng)基中，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株的復(fù)篩

1.3.2.1 搖瓶培養(yǎng)

用接種針從保存斜面中挑取少量菌絲點(diǎn)種于PDA培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)直徑達(dá)4～5 cm后，無菌條件下用φ= 6 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅4塊，接至含100 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)4 d，用4層紗布過濾，分別收集菌體細(xì)胞和發(fā)酵液，4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化虎杖苷實(shí)驗(yàn)

取10 mg/mL虎杖苷甲醇溶液0.2 mL、菌體細(xì)胞2 g(濕重)依次加入到含有19.8 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)的100 mL三角瓶中，在30 ℃，180 r/min的條件下，轉(zhuǎn)化48 h后，取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)。每個(gè)菌株進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

上述體系中，不加菌體細(xì)胞同法操作作為底物對(duì)照，用0.2 mL甲醇代替虎杖苷溶液同法操作作為菌體對(duì)照。

1.3.2.3 發(fā)酵液轉(zhuǎn)化虎杖實(shí)驗(yàn)

取10 mg/mL虎杖苷甲醇溶液0.2 mL、發(fā)酵液1 mL依次加入到含有19 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)的100 mL三角瓶中，在30 ℃，180 r/min的條件下，轉(zhuǎn)化48 h后，取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè)。每個(gè)菌株進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

上述體系中，用1 mL液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵液同法操作作為底物對(duì)照，用0.2 mL甲醇代替虎杖苷溶液同法操作作為菌體對(duì)照。

1.3.3 菌株鑒定

菌株總DNA的提取參照WEILAND[26]所述方法進(jìn)行。

DNA的PCR擴(kuò)增使用PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行。按照試劑盒說明書加樣，其中，引物分別為ITS1和ITS4。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸7 min[27]。

用10 g/L的瓊脂糖凝膠、0.5×TBE為電泳緩沖液、80 V電壓進(jìn)行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。將電泳合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列分析，測(cè)序分析數(shù)據(jù)在美國NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行DNABlast比對(duì)分析，獲取比對(duì)指標(biāo)靠前的相似序列，在MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的歸屬。

1.3.4 HPLC分析

1.3.4.1 色譜條件

采用HPLC方法測(cè)定轉(zhuǎn)化液中的虎杖苷和白藜蘆醇[28]。測(cè)定在安捷倫Agilent 1260色譜儀上進(jìn)行，色譜柱為Phenomenex Luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測(cè)器為DAD二極陣列管，檢測(cè)波長(zhǎng)305 nm，柱溫為30 ℃，流動(dòng)相流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相的組成為乙腈和甲酸水溶液(體積比35∶65)。在該色譜條件下，虎杖苷和白藜蘆醇的保留時(shí)間分別為3.22、6.06 min。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別稱取虎杖苷和白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品各 0.5 g，用甲醇溶解定容，配制成 1 mg/mL虎杖苷、白藜蘆醇儲(chǔ)備液，備用。并將其稀釋成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL。以樣品質(zhì)量濃度作為x軸，峰面積作為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中虎杖苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=22 965x-13.224(相關(guān)系數(shù)r=0.999 6)，白藜蘆醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=74 886x-0.998 3(相關(guān)系數(shù)r=0.998 1)。

1.3.4.3 虎杖內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化虎杖苷的HPLC分析

將樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，按上述方法進(jìn)行HPLC分析，按公式(1)計(jì)算產(chǎn)物白藜蘆醇的摩爾轉(zhuǎn)化產(chǎn)率：

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果

按1.3.1小節(jié)的方法，以虎杖苷為唯一碳源進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，共分離純化獲得4株長(zhǎng)勢(shì)良好的虎杖內(nèi)生真菌，將其分別編號(hào)為HZ001、HZ002、HZ003和HZ004。

在馬鈴薯葡萄糖平板培養(yǎng)基上，HZ001菌落疏松、干燥、不透明，呈絨毛狀，為紅褐色。HZ002菌落生長(zhǎng)快，表面成黑色粉末狀。HZ003最初為黃色，后變?yōu)辄S綠色至顏色變暗、平坦、反面無色。HZ004為灰色隆起，邊緣整齊，表面光滑、突起。顯微鏡檢結(jié)果表明，HZ001菌株基部沒有假根，也沒有足細(xì)胞，頂部形成了球狀的頂囊，菌絲有無隔膜，孢子連著一條分枝形成類似蝌蚪狀的形態(tài),孢子的形狀呈球狀。HZ002分生孢子有橫隔，光滑,頂端不形成膨大的頂囊,菌絲有橫隔，基部無足細(xì)胞。HZ003有球形或近球形的分生孢子，黃綠色，孢子直徑大，分生孢子梗上再生長(zhǎng)出膨大的頂囊，近球形。HZ004菌絲呈分隔狀，分生孢子頭呈連珠狀，且可見孢子梗上有孢子囊，梗上有分生孢子，分生孢子梗粗糙無色，頂囊呈球形。

2.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

按照1.3.2小節(jié)的方法對(duì)初篩的4株虎杖內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的性能進(jìn)行復(fù)篩，菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系和發(fā)酵液轉(zhuǎn)化體系的HPLC分析結(jié)果分別見圖1和圖2。

由圖1可知，與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(虎杖苷和白藜蘆醇質(zhì)量濃度均為1 mg/mL甲醇溶液)相比較，HZ001(圖1，C)和HZ004(圖1，I)的菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化中底物虎杖苷的色譜峰消失，在6.06 min處出現(xiàn)產(chǎn)物白藜蘆醇色譜峰，表明HZ001和HZ004菌體細(xì)胞具有較好的轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的活性。HZ002(圖1，E)和HZ003(圖1，G)的菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中底物虎杖苷的色譜峰消失，但未出現(xiàn)新色譜峰，表明HZ002和HZ003能夠利用或吸附虎杖苷，但未轉(zhuǎn)化生成胞外新產(chǎn)物。

圖1 虎杖內(nèi)生真菌菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)化虎杖苷的HPLC圖Fig.1 HPLC diagrams of transformation of polydatin by the cells of endophytic fungi from Polygonum cuspidatum

圖2 虎杖內(nèi)生真菌發(fā)酵液轉(zhuǎn)化虎杖苷的HPLC圖Fig.2 HPLC diagrams of transformation of polydatin by the fermentation broths of endophytic fungi from P.cuspidatum

由圖2可知，HZ001(圖2，C)、HZ003(圖2，G)和HZ004(圖2，I)的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化體系中均出現(xiàn)了白藜蘆醇色譜峰，表明該3菌株發(fā)酵液中均有一定的胞外酶活性。

按1.3.4.3小節(jié)的方法分別計(jì)算各菌株菌體細(xì)胞和發(fā)酵液轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的摩爾轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，結(jié)果如表1所示。

表1 虎杖內(nèi)生真菌轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率Table 1 Conversion yields of polydatin to resveratrol by endophytic fungi from P.cuspidatum

由表1可知，HZ001和HZ004菌株細(xì)胞轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率均可達(dá)100%。3菌株HZ001、HZ003、HZ004的發(fā)酵液轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率分別為51%、40%和38%。綜上可知，從虎杖中分離獲得的4株內(nèi)生真菌中，HZ001和HZ004轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的活性最好，其主要靠胞內(nèi)酶發(fā)揮作用，而HZ003具有一定的轉(zhuǎn)化效果，其以胞外酶起作用。

2.3 菌株鑒定結(jié)果

按1.3.3小節(jié)的方法對(duì)菌株的DNA進(jìn)行提取和PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，4株虎杖內(nèi)生真菌DNA的分子量均為650 bp左右。對(duì)菌株序列進(jìn)行分析，將分析結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，然后挑選同源性較高的菌株序列，采用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。結(jié)果表明，HZ001和HZ002分別歸屬為Aspergillusaculeatus和Penicilliumgeorgiense，HZ003和HZ004則均歸屬為Aspergillusflavus。

圖3 虎杖內(nèi)生真菌DNA提取物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 瓊脂糖凝膠電泳譜圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis photograph of PCR products from DNA extracts of the endophytic fungi from P.cuspidatum

圖4 虎杖內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the endophytic fungi from P.cuspidatum

3 結(jié)論

虎杖作為我國常用中藥，臨床用途非常廣泛，其有效成分白藜蘆醇在醫(yī)藥、食品、化妝品中的應(yīng)用也越來越廣泛。本文以虎杖苷為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基從廣西產(chǎn)新鮮虎杖中分離出4株內(nèi)生真菌HZ001、HZ002、HZ003和HZ004。菌體細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵液生物轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果表明， HZ001和HZ004轉(zhuǎn)化虎杖苷生成白藜蘆醇的性能最強(qiáng)，在本實(shí)驗(yàn)的條件下白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率可達(dá)100%，其主要靠胞內(nèi)酶發(fā)揮作用。而HZ003具有一定的轉(zhuǎn)化效果，其以胞外酶起作用，白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率約為40%。菌株鑒定結(jié)果表明，HZ001和HZ002分別歸屬為Aspergillusaculeatus和Penicilliumgeorgiense，HZ003和HZ004則均歸屬為Aspergillusflavus。