畢赤酵母產(chǎn)伏馬毒素B1羧酸酯酶發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的優(yōu)化

趙一凡，常曉嬌，杜穩(wěn)，孫長坡，劉虎軍

(國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京，100037)

伏馬毒素(fumonisins)主要是由串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物[1-2]，在自然界中是一種分布比較普遍的真菌毒素。目前共發(fā)現(xiàn)28種伏馬毒素[3]，其中伏馬毒素B1(fumonisin B1，F(xiàn)B1)的占比最高、毒性最強(qiáng)、分布最廣，主要污染玉米及玉米制品[4-5]。伏馬毒素隨著食物鏈傳遞會(huì)嚴(yán)重危害人畜的健康，人類食用被伏馬毒素污染的食品可能會(huì)誘發(fā)食道癌、結(jié)腸癌等多種疾病[6-7]；豬、馬、牛等動(dòng)物取食被伏馬毒素污染的飼料，會(huì)對其器官產(chǎn)生致命毒性，從而引起多種疾病[8]。糧油食品被伏馬毒素等真菌毒素污染后將會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。

伏馬毒素非常穩(wěn)定，250 ℃熱處理也不能脫除玉米中的伏馬毒素[9]。目前有物理法和化學(xué)法等脫毒方法[2]，但這些方法還存在破壞食品營養(yǎng)價(jià)值、安全性低、穩(wěn)定性差等問題。除此以外，生物法利用微生物或酶的作用可將伏馬毒素轉(zhuǎn)化為低毒或無毒產(chǎn)物，脫毒效果穩(wěn)定且無污染，是一種非常有前景的方法[10]。其中微生物法在很多食品加工等領(lǐng)域并不能廣泛適用，相比之下酶法具有操作簡單、專一性強(qiáng)、催化效率高等優(yōu)點(diǎn)而廣受青睞。FB1生物降解的本質(zhì)是在酶的催化下完成的，HEINL等[11]在Sphingopyxissp.MTA144的同一個(gè)基因簇上找到了降解FB1的2個(gè)關(guān)鍵基因，F(xiàn)B1經(jīng)2步酶促反應(yīng)降解：在羧酸酯酶的作用下，F(xiàn)B1被降解為HFB1，毒性顯著降低[12]；在轉(zhuǎn)氨酶的作用下HFB1發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)化成2-酮基-HFB1。

優(yōu)化發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分，創(chuàng)造適合菌體生長和代謝的最佳條件以充分發(fā)揮菌種的潛力，是提高FB1羧酸酯酶產(chǎn)量的首要步驟。由于微生物發(fā)酵系統(tǒng)十分復(fù)雜且高度非線性，因此需要建立一個(gè)準(zhǔn)確適合的發(fā)酵模型。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)是對人類大腦的一種物理結(jié)構(gòu)上的模擬，其中誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)即BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在擬合復(fù)雜的非線性關(guān)系方面具有顯著優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基優(yōu)化[13]、發(fā)酵過程控制[14]等發(fā)酵工業(yè)領(lǐng)域。

目前已鑒定的FB1降解酶數(shù)量十分有限，關(guān)于FB1羧酸酯酶等降解酶的發(fā)酵優(yōu)化也少有報(bào)道。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的畢赤酵母工程菌(ASAG156)為FB1羧酸酯酶的生產(chǎn)菌株，通過單因素試驗(yàn)對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過Plackett-Burman試驗(yàn)、正交試驗(yàn)和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以充分發(fā)揮菌株的生產(chǎn)性能，進(jìn)一步提高FB1羧酸酯酶的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

FB1羧酸酯酶產(chǎn)生菌：畢赤酵母工程菌ASAG156，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈(色譜級)，美國Thermo Fisher公司；FB1標(biāo)準(zhǔn)品，PriboLab公司；酵母粉，英國Oxoid公司；蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他常用生化試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基及溶液

酵母膏胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 10，蛋白胨 20；固體YPD培養(yǎng)基另外加入20 g/L的瓊脂粉。

BMGY培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base, YNB)13.4，生物素 4×10-4，甘油 10，磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)0.1 mol/L。

BMMY培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，YNB 13.4，生物素 4×10-4，甲醇 10，磷酸鉀緩沖液(pH6.0)0.1 mol/L。

FM22生長培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO443，(NH4)2SO45，CaSO4·2H2O 1.27，K2SO414.3，MgSO4·7H2O 11.7，PTM4 2(mL/L)，甘油 40，KOH溶液調(diào)節(jié)PH至6。

FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基(g/L)：KH2PO443，(NH4)2SO45，CaSO4·2H2O 1.27，K2SO414.3，MgSO4·7H2O 11.7，PTM4 2(mL/L)，甲醇 10，KOH溶液調(diào)節(jié)PH至6。

PTM4(Pichiatrace minerals 4)微量元素溶液(g/L)：CuSO4·5H2O 2，KI 0.089，MnSO4·H2O 3，Na2MoO4·2H2O 0.2，H3BO30.02，CaSO4·2H2O 0.5，CoCl20.5，ZnCl27，F(xiàn)eSO4·7H2O 22，生物素 0.2，濃硫酸 1 mL/L。

1.1.4 儀器與設(shè)備

ECOTRON型恒溫?fù)u床，瑞士Infors公司；Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；EVOLUTION 300紫外可見分光光度計(jì)，美國Thermo Fisher公司；Waters e2695高效液相色譜儀、2475熒光檢測器、Waters XBridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Waters公司；PP60型pH計(jì)，德國Sartorius公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

種子活化：取適量保存在冷凍甘油管中的菌液劃線接種于YPD固體平板上，30 ℃培養(yǎng)48～72 h。

種子培養(yǎng)：挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下，培養(yǎng)24 h。

1.2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

將經(jīng)YPD培養(yǎng)后的種子液以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接入BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16～24 h，OD600達(dá)到5～6，將全部細(xì)胞轉(zhuǎn)接到BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)；搖瓶發(fā)酵初始條件：初始pH 6.0，在30 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇，誘導(dǎo)72 h取樣并測定發(fā)酵上清中FB1羧酸酯酶酶活力。在下列條件下依次進(jìn)行單因子搖瓶發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

(1)誘導(dǎo)時(shí)間：誘導(dǎo)溫度30 ℃，初始pH 6.0，每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇。分別在24、48、72、96和120 h取樣并測定酶活力，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

(2)甲醇體積分?jǐn)?shù)：誘導(dǎo)溫度30 ℃，初始pH 6.0，每24 h分別補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%和3%的甲醇，96 h取樣并測定酶活力，確定最佳甲醇添加量。

(3)培養(yǎng)基初始pH：誘導(dǎo)溫度30 ℃，配制初始pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的培養(yǎng)基，每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇，96 h取樣并測定酶活力，確定最佳培養(yǎng)基初始pH。

(4)誘導(dǎo)溫度：誘導(dǎo)溫度分別為25、28、30和35 ℃，初始pH 6.0，每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇，96 h取樣并測定酶活力，確定最佳誘導(dǎo)溫度。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加10 g/L酵母粉，20 g/L蛋白胨組成新的發(fā)酵培養(yǎng)基，使用Minitab軟件進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析，研究發(fā)酵培養(yǎng)基中的8種成分。每個(gè)因素取高(+1)、低(-1)2個(gè)水平，以酶活力為響應(yīng)值。各組分及其水平設(shè)置見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定的因素及水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

1.2.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果，以蛋白胨、KH2PO4、PTM4為變量，各因素設(shè)計(jì)3水平，正交試驗(yàn)因素與水平如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3.3 BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

使用Matlab R2018a軟件，以正交試驗(yàn)結(jié)果作為訓(xùn)練和測試數(shù)據(jù)樣本，根據(jù)培養(yǎng)基影響因子和優(yōu)化目標(biāo)確定神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入輸出。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 FB1的HPLC檢測

FB1前處理及儀器的檢測條件參考GB 5009.240―2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中伏馬毒素的測定》。

1.2.4.2 粗酶液制備

取一定量的發(fā)酵液置于離心機(jī)中，12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.4.3 酶活力測定

測定方法參照文獻(xiàn)[15]。酶活力定義：在37 ℃和pH 7.4條件下，每分鐘降解1 μg FB1所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素?fù)u瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

由圖1-a可知，隨著甲醇誘導(dǎo)時(shí)間的延長，發(fā)酵上清液中酶活力逐漸增大，在96 h酶活力達(dá)到最大，誘導(dǎo)時(shí)間繼續(xù)延長而酶活力沒有明顯增大，因此選擇誘導(dǎo)96 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基中甲醇是重組菌的碳源和誘導(dǎo)劑，體積分?jǐn)?shù)合適的甲醇可以滿足酵母生長和產(chǎn)酶。由圖1-b可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，酶活力逐漸增大，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為1%時(shí)酶活達(dá)到最大，繼續(xù)增大甲醇體積分?jǐn)?shù)，酶活力迅速降低，過多的甲醇會(huì)對菌體產(chǎn)生毒害作用[16]，使產(chǎn)酶量降低，因此選擇體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基初始pH會(huì)影響細(xì)胞膜所帶電荷和培養(yǎng)基內(nèi)的物質(zhì)解離，從而影響菌體的代謝能力和產(chǎn)酶，同時(shí)pH會(huì)影響酶的穩(wěn)定性。由圖1-c可知，中性和堿性條件下酶活力較低，而當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.0時(shí)酶活力達(dá)到最大，因此選擇pH 6.0為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH進(jìn)行后續(xù)研究。每種菌的發(fā)酵產(chǎn)酶都有一個(gè)適宜的溫度范圍來使其產(chǎn)酶達(dá)到最優(yōu)水平，由圖1-d可知，重組菌產(chǎn)酶隨著誘導(dǎo)溫度的降低而升高，這表明低溫誘導(dǎo)有利于胞外產(chǎn)酶，但誘導(dǎo)溫度過低加大了能耗提高了發(fā)酵成本，因此選擇28 ℃為誘導(dǎo)溫度。

a-誘導(dǎo)時(shí)間；b-甲醇體積分?jǐn)?shù)；c-pH；d-誘導(dǎo)溫度圖1 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化Fig.1 Shaking flask optimization of fermentation conditions

經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，F(xiàn)B1羧酸酯酶酶活力有了顯著提高，即搖瓶最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH 6.0，每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇，在28 ℃下誘導(dǎo)96 h，發(fā)酵上清液中酶活力為300 U/mL，較優(yōu)化前提高了63%。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

FB1羧酸酯酶已在畢赤酵母工程菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，但BMMY這種復(fù)合培養(yǎng)基中包含價(jià)格高且需單獨(dú)過濾除菌的YNB和生物素等成分，操作不便；同時(shí)與發(fā)酵罐常用的BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基成分差別較大。FM22培養(yǎng)基是在BSM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上改進(jìn)后的另一種合成培養(yǎng)基，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性[17]、縮短發(fā)酵延遲期和發(fā)酵時(shí)間、提高比生長速率等優(yōu)點(diǎn)[18]。這些基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基在滅菌后均會(huì)出現(xiàn)大量乳白色沉淀，限制細(xì)胞的生長同時(shí)增大了蛋白下游分離提取純化等環(huán)節(jié)的難度。所以對FM22培養(yǎng)基成分的優(yōu)化將有助于目的蛋白的表達(dá)和分離純化。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌體在FM22生長培養(yǎng)基中能利用其豐富的鹽離子正常生長，但FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基中需添加有機(jī)氮源，F(xiàn)B1羧酸酯酶才能正常表達(dá)。因此參考BMMY培養(yǎng)基配方，將酵母粉和蛋白胨添加到FM22誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在搖瓶最優(yōu)發(fā)酵條件下，對新的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)結(jié)果分析

在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，按照表1對發(fā)酵培養(yǎng)基中8種成分進(jìn)行考察，以篩選出對酶活有顯著影響的因素進(jìn)一步優(yōu)化。按照Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)表設(shè)計(jì)，8個(gè)因素12次實(shí)驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)號酶活取平均值。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及顯著性分析見表3和表4。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experimental design

因素H的P值<0.05，對酶活力影響顯著；因素A的P=0.05，處于邊緣狀態(tài)，在處理時(shí)和H一并確認(rèn)為本試驗(yàn)的顯著影響因素，即蛋白胨和KH2PO4為酶活力的顯著影響因素。對酶活力影響排第3的因素是PTM4，由于PTM4中包含Cu2+、Mn2+、Na+、Ca2+、Zn2+、Fe2+和Co2+等金屬離子及生物素等，可以提供畢赤酵母用于生長和外源蛋白表達(dá)所需的微量元素[19]，因此將PTM4和蛋白胨、KH2PO4這3個(gè)因素作為接下來優(yōu)化試驗(yàn)的研究對象。其他對酶活力影響不顯著的因素：(NH4)2SO4、CaSO4·2H2O、K2SO4、MgSO4·7H2O和酵母粉，采取Plackett-Burman試驗(yàn)低水平濃度，減少鹽離子質(zhì)量濃度和沉淀的產(chǎn)生，同時(shí)節(jié)約成本，即K2SO47.15 g/L、MgSO4·7H2O 5.85 g/L和酵母粉 5 g/L。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素的影響Table 4 Effects of factors in the Plackett-Burman experiment

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

利用Minitab軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)和結(jié)果分析。采用L9(34)正交表設(shè)計(jì)并安排試驗(yàn)，因素水平見表2，以酶活力為考察指標(biāo)，對影響酶活力的3個(gè)因素蛋白胨、KH2PO4、PTM4進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)號重復(fù)3次，酶活力取平均值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal experiment

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

由表5正交試驗(yàn)結(jié)果可知，各因素對酶活力的影響程度依次為蛋白胨>KH2PO4>PTM4。由表6方差分析結(jié)果可知，蛋白胨和KH2PO4這2個(gè)因素對酶活力有顯著影響(P<0.05)，為主要因素；PTM4這個(gè)因素對酶活力的影響不顯著(P>0.05)，為次要因素；顯著性分析結(jié)果與Plackett-Burman試驗(yàn)一致。結(jié)合直觀分析，正交試驗(yàn)確定的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為蛋白胨 25 g/L、KH2PO454 g/L和PTM4 1.5 mL/L。

2.2.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立和應(yīng)用

2.2.3.1 建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型

經(jīng)證實(shí)對于含一個(gè)隱含層的3層結(jié)構(gòu)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，能以任意精度逼近有界區(qū)域上的任意連續(xù)函數(shù)[20]。因此本文以蛋白胨、KH2PO4、PTM4這3個(gè)影響因素為輸入神經(jīng)元，以酶活為輸出神經(jīng)元，構(gòu)建N為隱含層的3-N-1型BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)構(gòu)圖見圖2。

圖2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure of artificial neural network

表5正交試驗(yàn)的9組數(shù)據(jù)中，其中8組數(shù)據(jù)作為網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練數(shù)據(jù)，剩余1組數(shù)據(jù)作為測試數(shù)據(jù)。為了提高網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練效率，加快訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)的收斂性，同時(shí)防止計(jì)算過程中出現(xiàn)“過擬合”等問題，在訓(xùn)練前對樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，使數(shù)據(jù)全部歸于[0，1]之間，訓(xùn)練結(jié)束后再將輸出還原。本試驗(yàn)調(diào)用Matlab R2018a工具箱中的相應(yīng)函數(shù)進(jìn)行編程建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型并訓(xùn)練。隱含層節(jié)點(diǎn)數(shù)選為10，在此條件下該網(wǎng)絡(luò)具有足夠的泛化能力和輸出精度，訓(xùn)練函數(shù)為trainlm，隱含層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為tansig，輸出層神經(jīng)元的傳遞函數(shù)為pureline，最大訓(xùn)練迭代次數(shù)為50，其他各項(xiàng)參數(shù)選擇默認(rèn)值。訓(xùn)練后的網(wǎng)絡(luò)收斂于目標(biāo)誤差0.000 1，滿足精度要求。由此建立了反映發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨、KH2PO4、PTM4這3個(gè)因子與酶活之間非線性關(guān)系的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。

以網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值和實(shí)測值的相對誤差來評價(jià)網(wǎng)絡(luò)模型，結(jié)果見圖3。實(shí)測值和預(yù)測值的相對誤差絕對值為2%，這表明預(yù)測值與實(shí)測值有較好的吻合度，訓(xùn)練后的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測性能好、仿真度高，能夠很好地?cái)M合酶活力與3個(gè)影響因素之間的關(guān)系。因此該網(wǎng)絡(luò)模型可用于對酶活力結(jié)果的預(yù)測。

圖3 實(shí)測值與預(yù)測值的比較Fig.3 Comparison of experimental values and predicted values

2.2.3.2 利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)篩選最佳培養(yǎng)基配方

基于所建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，分別為蛋白胨、KH2PO4、PTM4這3個(gè)輸入因素選擇合適的步長，利用Matlab相關(guān)函數(shù)對每個(gè)因素定義域值進(jìn)行編程，通過sim函數(shù)對網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行仿真輸出并找到輸出值最大的組合。結(jié)果結(jié)果，利用BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行仿真模擬，在2 783種可能組合中篩選到的最優(yōu)誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為蛋白胨 23 g/L、KH2PO444 g/L和PTM4 1.5 mL/L。

正交試驗(yàn)是一種利用部分試驗(yàn)來代替全面試驗(yàn)的方法，通過挑選有代表性的試驗(yàn)點(diǎn)來減少試驗(yàn)次數(shù)[21-22]，但分析得到的結(jié)果受限于因素水平的設(shè)定；人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠快速準(zhǔn)確地仿真模擬所有試驗(yàn)條件，避免大量試驗(yàn)的同時(shí)能得出比正交試驗(yàn)更為精確的結(jié)果[23]。

2.2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別按照正交試驗(yàn)及BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化得到的培養(yǎng)基配方進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)，測定實(shí)際酶活力。正交試驗(yàn)得到的酶活力為402.64 U/mL，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化得到的酶活力為402.96 U/mL，與預(yù)測值的相對誤差小于2%，說明該BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可以很好的模擬發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨等3種組分添加量與酶活力的關(guān)系；另一方面BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化得到的培養(yǎng)基配方具有蛋白胨和KH2PO4添加量少的優(yōu)點(diǎn)，節(jié)約發(fā)酵成本的同時(shí)減少了無機(jī)鹽沉淀的產(chǎn)生。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與正交試驗(yàn)等多種優(yōu)化方法相結(jié)合，能夠反映多因素多水平間復(fù)雜的變化規(guī)律，在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方面的應(yīng)用較廣泛[24-26]。

3 結(jié)論

FB1羧酸酯酶在畢赤酵母中的搖瓶水平表達(dá)量偏低，本研究首先通過單因素試驗(yàn)對誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇體積分?jǐn)?shù)、培養(yǎng)基初始pH、誘導(dǎo)溫度這4個(gè)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，綜合考慮發(fā)酵成本等實(shí)際情況，確定了最適發(fā)酵條件即培養(yǎng)基初始pH 6.0，在28 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)，每24 h補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)為1%的甲醇，誘導(dǎo)96 h。對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，首先采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)快速篩選出蛋白胨、KH2PO4和PTM4這3個(gè)因素作為進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)的研究對象；采用正交試驗(yàn)建立數(shù)據(jù)樣本；利用Matlab R2018a軟件構(gòu)建3-10-1型BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蛋白胨 23 g/L、KH2PO444 g/L、PTM4 1.5 mL/L、K2SO47.15 g/L、MgSO4·7H2O 5.85 g/L和酵母粉 5 g/L。通過發(fā)酵條件和培養(yǎng)基的優(yōu)化，酶活力提高了1.19倍，達(dá)到402 U/mL以上，同時(shí)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽沉淀大量減少，便于蛋白分離純化等下游環(huán)節(jié)的進(jìn)行。本研究為實(shí)現(xiàn)畢赤酵母重組菌搖瓶發(fā)酵高效生產(chǎn)FB1羧酸酯酶提供了數(shù)據(jù)參考，下一步將通過高密度發(fā)酵優(yōu)化工藝進(jìn)一步提高FB1羧酸酯酶的產(chǎn)量，為伏馬毒素酶法脫毒的工業(yè)化應(yīng)用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。