威代爾冰葡萄酒發酵過程中香氣動態變化規律

唐柯，張小倩，李記明，姜文廣，徐巖*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺，264000)

冰葡萄酒是一種特殊的甜型葡萄酒，因其濃郁的香氣特征及獨特的口感，被譽為葡萄酒中的“液體黃金”[1]。香氣是決定冰葡萄酒質量的一個重要指標，也是當下冰葡萄酒研究的熱點[2-3]。冰酒的香氣受產地、品種、釀造工藝等多種因素影響。釀造工藝對冰酒香氣的影響，主要集中在酵母和發酵溫度上[4-5]。

目前在釀酒酵母對冰葡萄酒香氣特征性的影響方面已有較多研究，但主要還是以國外研究為主。ERASMUS等[6]比較了7種商業酵母菌株在冰酒釀造中的差異，結果表明ST、N96和EC1118最適宜冰酒生產。CRANDLES等[7]通過對不同酵母(V1116、VL1、EC1118、自然發酵)發酵冰酒香氣化合物研究發現，在雷司令冰酒中，EC1118產生的2-甲基-1-丁醇和乙酸異戊酯和癸酸乙酯濃度最高；在威代爾酒中，EC1118產生的大多數化合物濃度最高，但苯乙酸乙酯、葡萄螺烷、對乙烯基愈創木酚和1,1,6-三甲基-1,2-二氫萘在自然發酵的冰酒中含量更高。SYNOS等[8]以品麗珠為原料，使用3種酵母(V1116、EC1118、VL1)進行發酵并和自然發酵進行比對，發現EC1118和自然發酵冰酒的香氣活性物質含量最高，但是兩者的香氣活性物質種類有很大差異。而在我國的冰葡萄酵母的研究中，裴廣仁等[9]選用了9種商業酵母進行冰酒發酵，從冰酒的理化指標、風味組成和感官分析3方面綜合分析，認為WY1、WY3、WY4 具有發酵優質冰酒的潛力。張小倩等[10]對4種不同釀酒酵母(ST、K1、EC1118、R2)發酵的威代爾冰葡萄酒揮發性化合物進行分析，結果表明，R2酵母發酵的冰葡萄酒中醇類、酯類、羰基化合物的含量具有明顯優勢，且1-辛烯-3-醇、1-己醇、β-大馬士酮、里那醇、香葉醇、1-辛烯-3-酮等香氣化合物含量明顯高于其他酵母。上述研究可以發現，目前針對不同酵母對冰酒風味影響方面已經進行了較為詳細的研究，但是冰酒釀造過程中的香氣動態變化規律則鮮有人探究。

因此，本研究以遼寧本溪桓仁的威代爾冰葡萄為試材，采用頂空固相微萃取結合全二維氣相色譜質譜聯用(headspace solid-phase microextraction coupled with comprehensive two-dimensional gas chromatography time-of-flight mass spectrum, HS-SPME-GC×GC-TOFMS)對其發酵過程中不同時期的香氣化合物進行測定分析，研究威代爾冰葡萄酒酵過程中香氣化合物的變化規律。該研究不僅能豐富冰葡萄酒風味化學研究的理論基礎，同時也為進一步調控冰葡萄酒風味質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：2018年威代爾冰葡萄，遼寧本溪桓仁。

酵母：R2酵母，法國Lallemand公司。

試劑：2-辛醇、甲醇、二氯甲烷(色譜純)，美國 Sigma-Aldrich 公司；NaCl、Na2HPO4、檸檬酸、偏重硫酸鉀(分析純)，上海國藥集團試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Milli-Q超純水系統，美國 Millipore公司；固相萃取裝置，美國 Supelco 公司；Pegasus?4D全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀，LECO Corp., St. Joseph, MI, USA；Agilent DB-FFAP色譜柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)， Palo Alto, CA, USA; Restek Rxi-17Sil MS二維色譜柱(1.5 m×0.25 mm，0.25 μm), Bellefonte, PA, USA。

1.3 實驗方法

1.3.1 冰葡萄酒發酵及取樣

發酵溫度(12±1)℃，從發酵第0 天開始，每隔7 d取樣1次，直到發酵結束的第42天停止，共7個取樣點。

1.3.2 理化指標的測定

冰葡萄酒中總糖、總酸、pH、乙醇體積分數的測定參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行[11]。

1.3.3 HS-SPME-GC×GC-TOFMS定性分析

1.3.3.1 HS-SPME步驟

在20 mL頂空瓶中加入5 mL冰葡萄酒樣品及1.5 g NaCl，并添加10 μL 2-甲氧基苯酚-D3(內標物終質量濃度為609.76 μg/L)，具體程序：樣品萃取溫度為50 ℃，平衡時間為5 min，萃取時間為45 min，萃取時轉速為250 r/min。萃取頭于250 ℃下解吸附5 min，不分流。

1.3.3.2 GC×GC-TOFMS分析

GC×GC-TOFMS分析及質譜條件參照本課題組前期優化建立的方法[12]。

定性分析：對由Pegasus 4D工作站采集的數據，使用儀器自帶ChormaTOF軟件來解析，一維色譜峰的峰寬設為24 s，二維色譜峰寬設為0.2 s，自動識別大于200信噪比的色譜峰，然后進行自動積分解卷積和質譜庫(NIST14，Wiley 9)比對。相似度大于700作為篩選化合物的標準，去除色譜柱流出物含硅化合物與沒有風味貢獻的化合物，作為初步鑒定結果。在此基礎上，相同條件下分析一系列正構烷烴(C5～C30)的保留時間來確定每個化合物的色譜柱保留指數，并與文獻報道的保留指數比對確認，偏差在30以內的化合物作為最終定性的結果。

半定量分析：根據內標物的含量計算定性得到的化合物的相對含量，并進行數據分析。

1.3.4 數據處理

使用Excel 2019對威代爾冰葡萄酒中揮發性化合物定量數據進行計算；使用SPSS 22進行單因素方差分析(ANOVA)；使用SIMCA 13.0進行偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)。

2 結果與討論

2.1 理化指標的測定

針對發酵初始第0天的冰葡萄汁和發酵結束第42天的冰葡萄酒的基本理化指標進行了測定，通常發酵冰酒的葡萄汁含糖量介于300～400 g/L，總酸在8～12 g/L。而國標中規定冰葡萄酒的殘糖不得低于125 g/L，乙醇體積分數為9%～14%。根據理化指標的檢測數據可以看出，采用R2酵母釀造的冰葡萄酒總糖為141.5 g/L，乙醇體積分數為10.2%，均符合冰葡萄酒國家標準和工藝要求[13]。

表1 冰葡萄汁及冰葡萄酒的基本理化指標Table 1 Chemical composition of the Vidal ice wine juice and Vidal ice wine

2.2 發酵過程中冰葡萄酒游離態香氣化合物組分分析

2.2.1 冰葡萄酒游離態香氣化合物的定性分析

在所有發酵過程中的冰葡萄酒樣中共定性出507種揮發性香氣化合物，其中酯類131種、萜烯類45種、醇類97種、酸類25種、含氮化合物10種、揮發酚類20種、含硫化合物5種、芳香族化合物68種、內酯類19種、醛類22種、酮類50種、呋喃類15種。各類化合物所占比例如圖1所示，其中酯類化合物種類所占的比例最多，占總量的25.84%，其次是醇類、芳香族及萜烯類化合物。

圖1 發酵過程中揮發性香氣化合物種類匯總Fig.1 Summary of volatile aroma compounds during fermentation

2.2.2 冰葡萄酒游離態香氣化合物的定量分析

通過對發酵過程中酒樣的各類別化合物的含量分析發現(圖2)，醇類、芳香族類、酯類、酸類、萜烯類、酚類、含氮類、呋喃類、內酯類、醛類化合物的總含量初期都是隨著發酵的進行逐漸增加，并在發酵第14天時達到最高，隨后含量降低并趨于穩定；而酮類化合物總含量隨著發酵的進行一直降低，在發酵第14天時含量達到最低后趨于穩定；含硫類化合物則是隨著發酵的進行含量逐漸升高，并在發酵第28天達到最高，隨后又逐漸降低。

圖2 發酵過程中揮發性香氣化合物含量變化Fig.2 Change of volatile aroma compounds in fermentation process 注:黑色圖例化合物含量對應左邊縱坐標； 白色圖例化合物含量對應右邊縱坐標

通過比較發酵初始與發酵結束2個時間點(發酵第0天與發酵第42天)的各類化合物含量發現，除酮類化合物含量減少，酯類、醇類、酸類、萜烯類、內酯類、芳香族類、酚類、醛類、醚類、含氮化合物類、含硫類化合物含量均增加。根據以上的結果，主要針對發酵過程中揮發性化合物中既具有香氣特征(與香氣物質數據庫Flavornet Home進行比對[14])同時具有顯著性差異的香氣化合物進行匯總分析，結果見表2。

酯類：在發酵過程中酯類化合物的含量有顯著性差異的共有22種，其中乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、丁二酸二乙酯、丁酸乙酯、十一酸乙酯、戊酸乙酯等的相對含量較高。這些呈果香味的酯類的含量較發酵前都有所增加，乙酸異戊酯(香蕉香)的含量經過發酵后增加了35%，乙酸異丁酯(水果香)、乙酸丁酯(梨香)、丁二酸二乙酯(水果香氣)、丁酸乙酯(蘋果香氣)、十一酸乙酯(椰子香)、戊酸乙酯(水果香)的含量在經過發酵后分別增加了2～3倍。經過發酵后的提供果香的中長鏈脂肪酸酯的含量增加，會明顯的改善冰酒的感官品質[15]，并且這種變化也與以往威代爾冰葡萄酒發酵過程中酯類的變化規律相似[16]。

醇類：發酵階段揮有顯著性變化的醇類共有22種。在發酵結束的酒中，1-己醇、2，3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、1-丙醇、3-辛醇的含量較高。經過發酵后，具有花香、甜香、青草味的1-己醇增加了11%，呈水果香氣的2,3-丁二醇比發酵前的冰葡萄汁含量增加了2倍，黃瓜香氣的2-壬醇增加了3倍。

酸類：在整個發酵過程中，6種酸的含量有顯著性差異，其中己酸、丁酸、癸酸、十二酸、戊酸等中長鏈脂肪酸的含量都增加，這也與葡萄酒發酵發酵過程中羧酸類化合物的變化趨勢一致[17]，較高的酸類物質會給葡萄酒風味帶來負面影響，但是也有研究顯示較低含量的酸可以通過增加香氣的復雜性來提高葡萄酒的品質[18]。而乙酸作為高糖脅迫下酵母產生的主要揮發酸，其含量會影響冰到葡萄酒的質量[19]。發酵結束時乙酸的含量比發酵前增加了2倍，并且在發酵結束后乙酸酯的含量增加也可能與乙酸的含量增加相關。

醛、酮類：在GC-MS分離過程中，羰基化合物和酯類的分離比較困難，往往檢出率較低[17]，但是在GC×GC-TOFMS的分離下，有較多的羰基化合物檢出。醛酮類化合物的總含量隨著發酵的進行而降低，在5種具有顯著性的醛類中呈柑橘香氣的壬醛相對含量最高，其次是呈杏桃香氣的桃醛，且這5種醛在發酵結束后含量都降低。酮類中的呈奶油香氣閾值的2,3-丁二酮含量較發酵前明顯降低，但呈熱牛奶香氣的2-壬酮的含量卻從6.97 g/L增加到了43.60 g/L。

萜烯類：萜烯類化合物雖然在葡萄酒中含量較低，但因其較低的閾值，而對葡萄酒的香氣有較大的貢獻。經過發酵，具有顯著性差異的萜烯化合物共有24種，其中冰葡萄酒中比較重要的物質，如呈現花香的橙花醚、玫瑰醚和蜂蜜香氣的β-大馬酮、花香和木香的芳樟醇、檸檬香氣的松油烯[20]的含量都比較高。萜烯含量的增加，一方面可能在冰酒較長的發酵時間中通過酸解對糖苷結合態的萜烯類化合物進行較好的釋放，另一方面也有可能R2酵母具有β-葡萄糖苷酶的活性，通過酶解對結合態香氣進行釋放，其具體釋放原因還有待進一步研究。

芳香族類：苯甲醇、苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯的含量都比較高，且這些物質都主要呈現花果香和甜香，尤其是呈現玫瑰香氣的乙酸苯乙酯的含量最高，其次是苯乙醇含量在發酵結束時有明顯增加，其不僅可在發酵過程中形成，也可由結合態香氣前體釋放[21]，這種增加也在之前的研究中有相關報道[18]。其他幾種芳香族化合物也有不同程度的增加，但是沒有苯乙醇的含量增加顯著。

2.2.3 PLS-DA分析

將具有顯著性差異的揮發性化合物進行PLS-DA分析，最終，有36個化合物的變量投影重要性值大于1.0。根據這36個差異化合物作圖(圖3)，7個取樣點的樣品聚集在不同的分區，其中發酵前期3個取樣點的差異明顯，也就說明在發酵初始階段，葡萄汁中的揮發性香氣化合物的種類與含量會隨著發酵的進行產生很大的變化，發酵第0天與己酸己酯、2,3-戊二酮、2,3-丁二酮、香草酸乙酯相關性較高，發酵第7天則與香葉醇相關，發酵第14天與壬醛、1-辛烯-3-酮、乙酸異丁酯、乙酸丁酯、2,3-丁二醇、丁酸甲酯、苯酚相關。在發酵的后期冰葡萄酒中的揮發性成分已經趨于一個較穩定的狀態，到發酵中后期的樣本則比較聚集，主要與香茅醇、芳樟醇、3-辛酮相關；發酵結束的第42天則與水芹烯、1-丁醇、松油烯、γ-萜品烯、DL-檸檬烯、1,4-桉葉素、芳樟醇氧化物等化合物相關。最終經過酵母發酵，冰葡萄汁和冰葡萄酒的揮發性組分已經有了明顯區別。果酒經過酵母發酵后，無論是香氣物質的種類和含量都會發生一定變化，與孫佳勰等[22]研究發現發酵初始與發酵結束后香氣物質產生顯著差別，而發酵后期香氣變化相對較小，樣本則更為集中的結果相一致。

圖3 發酵過程中揮發性香氣化合物PLS-DA圖Fig.3 Volatile aroma compounds analysis with PLS-DA

3 結論

本研究采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS分析了R2酵母發酵威代爾冰葡萄酒在發酵過程中香氣化合物的變化規律，結果表明，R2酵母發酵后冰葡萄酒的揮發性組分較初始發生了明顯變化，醇類、芳香族類、酯類、酸類、萜烯類、酚類、含氮類、呋喃類、內酯類、醛類化合物的總含量都是隨著發酵的進行逐漸增加，并在發酵第14天時達到最高，隨后含量降低并趨于穩定。而酮類化合物總含量隨著發酵的進行一直降低，在發酵第14天時含量最低后趨于穩定；含硫類化合物則是隨著發酵的進行含量逐漸升高，隨后又逐漸降低。此外，通過對比發酵前后結合態化合物含量變化，發現發酵結束時，除酮類化合物含量減少，其他類化合物含量均增加。PLS-DA分析結果表明發酵前期(0、7、14 d)揮發性化合物變化較為顯著，到發酵中后期的樣本則相對變化較小，揮發性化合物趨于一個較穩定的狀態。