超聲波預處理對玉米醇溶蛋白結構及其Pickering乳液穩定性的影響

孫燁，李英浩，WULANDARI，呂麗爽，張秋婷

(南京師范大學 食品與制藥工程學院，江蘇 南京，210000)

近年來，隨著消費者對健康食品的需求與日俱增，可食用聚合物在食品工業中用作乳化劑、增稠劑等相關研究也越來越多，尤其是蛋白質[1]。玉米醇溶蛋白(zein)作為玉米中重要的貯藏蛋白，由于其結構的兩親性特征[2-3]，能夠在溶劑極性變化下自組裝形成近圓形納米顆粒(zein nanoparticle，ZNP)[4]。但是，ZNP表面存在大量疏水性氨基酸，導致其在水溶液中容易絮凝沉淀，因此很多研究利用多糖如阿拉伯膠[5]、黃原膠[6]和果膠[7]等作為疏水性蛋白的保護層，通過靜電、疏水等作用力相結合，提高親水性從而形成穩定的乳液[4]。亞麻籽膠(flaxseed gum，FSG)是從亞麻籽殼中提取的一種親水膠體，也是一種可溶性的膳食纖維，具有較強的營養價值[8]。不僅如此，FSG還具有多種功能性質，增稠性可以提高溶液體系穩定性，由于分子結構上結合了少量蛋白質，FSG也具有表面活性和乳化性，可穩定水包油型(oil in water,O/W)乳液[9-10]。將亞麻籽膠與醇溶蛋白結合，發揮親水膠體優勢，可顯著提升乳液體系穩定性。

Pickering乳液的穩定性很大程度上決定于液滴表面固體顆粒的大小、分布、極性和微觀形貌等因素，可以通過各種物理、化學和酶法等手段對其進行改性優化。已有研究表明，超聲波可以通過改變乳清蛋白、牛血清蛋白和花生蛋白等動植物蛋白質的結構，進而影響蛋白質的粒徑及功能性質[11-13]。然而，上述結論是建立在水溶性蛋白質的超聲波處理上，鮮少有研究關于超聲波對醇溶蛋白的作用，尤其是醇溶液中的玉米蛋白和小麥蛋白等。因此，擬研究超聲波預處理對醇溶液中zein結構的影響，在此基礎上，進一步探究不同超聲波條件處理對zein與FSG復合物的穩定性的影響。

本文利用不同條件的超聲波處理zein醇溶液，通過反溶劑沉淀法制備ZNP；然后，將不同處理所得的ZNP與FSG通過靜電相互作用等形成蛋白-多糖復合顆粒，進一步觀察超聲波預處理對ZNP-FSG復合顆粒性質的影響；最后利用ZNP-FSG復合顆粒均質制備成Pickering乳液，利用顯微鏡觀察、液滴粒徑和高溫實驗探究超聲波預處理對乳液特性的影響，為將超聲波應用于Pickering乳液制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，上海麥克林生化科技股份有限公司；亞麻籽膠，上海源葉生物科技有限公司；金龍魚食用植物調和油，益海嘉里食品有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NaOH、HCl等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JY-IIN型超聲細胞破碎儀，浙江寧波新芝儀器有限公司；Nano-ZS納米粒度儀，英國Malvern公司；F97Pro型熒光光譜儀，上海棱光技術有限公司；CHIRASCAN型數字式圓二色光譜儀，英國Applied Photophysics公司；FJ200-SH型高速分散機，上海標本模型廠；Alpha 1-2 D Pius冷凍干燥機，德國Marin Christ公司；JSM-5610LV型高分辨掃描電子顯微鏡-X射線能譜儀，日本JEOL公司；IX73型倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲波預處理

稱取1.0 g玉米醇溶蛋白溶于40 mL體積分數80%的乙醇溶液中，磁力攪拌器1000 r/min攪拌1 h，使其充分溶解，用離心管分裝成4份，每份樣品10 mL，空白組為N-zein。取樣品進行超聲波處理,超聲儀最大功率680 W，參數設置條件分別為U1∶10%-20 min、U2∶10%-40 min、U3∶20%-20 min、U4∶30%-20 min、U5∶40%-20 min，超聲探頭直徑6 mm，換算為功率強度分別約為U1∶230 W/cm2-20 min、U2∶230 W/cm2-40 min、U3∶460 W/cm2-20 min、U4∶690 W/cm2-20 min、U5∶920 W/cm2-20 min。超聲波處理過程中，探頭充分浸沒于樣品溶液中，并保持樣品管置于冰浴中以控制樣品溫度低于5 ℃。超聲波處理時采用工作5 s，暫停5 s的工作模式，處理完畢，放入4 ℃冰箱24 h過夜。

1.3.2 玉米醇溶蛋白納米顆粒的制備

采用反溶劑沉淀法，按照JIANG等[14]的方法并稍作修改。將10 mL超聲波處理的玉米醇溶蛋白乙醇溶液倒入堿式滴定管，將裝有30 mL蒸餾水的燒杯置于超聲波水浴中，開啟超聲波防止絮凝物出現，使滴定管中的樣品逐滴滴入，直至結束。最后，進行旋轉蒸發除去多余的乙醇，水浴溫度為45 ℃，旋至蛋白質質量濃度為20 mg/mL，并調節溶液pH至4.0，放入4 ℃冰箱保存，備用。

1.3.3 內源熒光光譜測定

采用王中江等[15]的方法。用pH 4.0的去離子水將樣品稀釋至質量濃度1 mg/mL，測定條件為波長295 nm處激發，掃描范圍為300～400 nm、狹縫寬度為5 nm和掃描速度為1 200 nm/min，記錄發射光譜。

1.3.4 二級結構測定

參照ERICKSON等[16]的方法。采用遠紫外區圓二色譜探究超聲波處理對zein二級結構的影響。測定在室溫(25 ℃)、持續通氮氣的條件下進行，利用體積分數80%的乙醇溶液將樣品稀釋至質量濃度0.2 mg/mL，掃描速度為100 nm/min，掃描范圍為190～260 nm，帶寬1 nm，樣品池光程為1 mm。使用Dicroprot軟件對所收集的數據進行分析。

1.3.5 粒徑和zeta電位測定

粒徑測定采用JIANG等[7]的方法，采用納米粒度儀測定ZNP和ZNP-FSG復合顆粒的粒徑，測量前將所有樣品用pH 4.0的去離子水稀釋至質量濃度1 mg/mL。在室溫(25 ℃)下測定粒徑、分散性指數以及電位，。

1.3.6 ZNP-FSG復合顆粒的制備

配制質量濃度為10 mg/mL亞麻籽膠水溶液，水浴95 ℃、磁力攪拌1 h至完全溶解，調節pH至4.0，放置冰箱24 h過夜。將10 mL 質量濃度10 mg/mL的ZNP溶液與10 mL質量濃度10 mg/mL的FSG溶液等體積混合，使ZNP與FSG質量比為1∶1，15 000 r/min下高速均質2 min，混合，放入冰箱靜置24 h過夜，備用。

1.3.7 表面疏水性測定

根據KATO等[17]采用ANS作為熒光探針對樣品的表面疏水性進行測定。在5 mL ZNP中加入50 μL 8.0 mmol/L的ANS溶液(pH 4.0)，用pH 4.0的去離子水將樣品稀釋成一定梯度(0.01～1 mg/mL)，用熒光分光光度計在390 nm激發波長下測定樣品的熒光強度，掃描范圍為400～600 nm，狹縫寬度為5 nm。用線性回歸分析法計算熒光強度對蛋白質質量濃度的初始斜率，作為蛋白質表面疏水性指數。

1.3.8 形貌特征觀察

將樣品溶液凍干成粉末，稱取少量樣品，凍干后的樣品黏附到導電膠，然后粘到圓柱形的樣品柱上。采用高分辨掃描電子顯微鏡對ZNP及ZNP-FSG復合顆粒微觀結構進行觀察。

1.3.9 Pickering乳液的制備

將ZNP-FSG復合膠體顆粒溶液與食用油按體積比1∶1混合，油水體系采用剪切分散機于18 000 r/min下剪切3 min，將形成的Pickering乳液放置于4 ℃冰箱儲藏，備用。

1.3.10 液滴尺寸及形態觀測

根據ZHU等[18]的方法，采用粒度分布儀測定乳液的粒徑和電位。參數設置為：分散劑,水；顆粒折射率1.460；顆粒吸收率0.001；分散劑折射率1.330。采用面積平均直徑d32來表征顆粒和乳液液滴粒度的大小。

顯微鏡觀察：吸取中部位置乳液50 μL,緩慢滴入載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，防止液滴破裂，分別在4和40倍物鏡下用倒置顯微鏡進行觀察，連接顯微成像系統DP80相機，使用圖像采集軟件CellSens standard觀察液滴形態。

1.3.11 耐高溫穩定性

將新鮮制備的乳液倒入統一規格的具塞玻璃管，置于80 ℃水浴30 min后，立即置于冰浴降溫至室溫并取出，觀察乳液前后穩定性的差異，用顯微鏡放大4倍觀察乳液液滴形態。

1.3.12 數據統計分析

實驗數據采用平均值±標準偏差表示，采用統計軟件SPSS 24.0對數據進行ANOVA差異顯著性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。采用Origin 2017軟件進行圖表處理。

2 結果與分析

2.1 超聲波預處理對玉米醇溶蛋白結構的影響

2.1.1 內源熒光光譜分析

蛋白質內源熒光的特點是由蛋白質中芳香氨基酸(色氨酸和酪氨酸等)所在位置的差異決定的，有助于評價蛋白質結構的變化及特點。不同超聲波預處理的玉米醇溶蛋白熒光光譜圖如圖1所示，醇溶液中玉米蛋白經295 nm激發后在385 nm附近出現熒光發射峰，含有高比例的乙醇溶液可能使色氨酸基團的最大吸收波長(λmax)從348 nm紅移至385 nm。天然的玉米醇溶蛋白表面含有較多疏水性氨基酸，可能存在色氨酸基團，導致其熒光強度較高[19]。與未處理的N-zein組比較，超聲波處理蛋白質的熒光強度均呈現一定程度地降低。研究表明，由于芳香族氨基酸特性，色氨酸殘基通常被完全或部分地埋在蛋白質的疏水核心內，超聲波引發的高剪切作用，使蛋白質結構變得松散，使緊緊相連的α-zein分子變得疏松，更多色氨酸開始暴露，接觸極性環境導致熒光強度降低[20]。隨著超聲強度從U1增加至U5,處理時間延長至U2，熒光強度不斷降低,說明蛋白質螺旋結構更加趨于開放。

圖1 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectrum of zein under different ultrasonic conditions

由不同超聲波預處理條件對玉米醇溶蛋白的最大發射峰位置的影響分析發現,U1、U3和U4處理組相較于N-zein藍移至382 nm，適宜的超聲強度和處理時間促使蛋白質結構中的色氨酸基團向內部疏水區域轉移。相反，U2和U5處理組的最大發射波長紅移至390 nm處，且熒光強度相近。對比超聲功率與超聲時間的影響發現,超聲時間的延長(U2∶230 W/cm2-40 min)較功率增加(U3和U4)影響程度更大，可顯著降低熒光強度，與超聲條件為 U5∶920 W/cm2-20 min時相當，最大熒光強度達到最低水平(66.5)。發射峰紅移的原因可能是由色氨酸周圍的空間環境結構發生變化，長時間和高強度的超聲波使芳香族氨基酸側鏈暴露在蛋白質的表面，其周圍的溶液極性升高，對結構產生了不利的影響。MATSUSHMIA等[21]發現,α-zein在體積分數70%的乙醇水溶液中呈帶狀，由10個左右相鄰的螺旋柱體結構反向平行排列構成，兩端通過谷氨酰胺與前后2個螺旋連接。而長時間和較高強度的超聲波處理使兩兩相鄰螺旋距離變大，空間結構變得更加開放。

2.1.2 圓二色光譜分析

圓二色光譜是用于評估蛋白質二級結構的常用技術手段之一，用于探究超聲處理對乙醇溶液中的玉米醇溶蛋白二級結構的影響。圖2顯示了N-zein與超聲處理組在190～260 nm的遠紫外圓二色光譜。所有zein處理組的圓二光譜在193 nm附近具有正峰，在202 nm處與零線相交，同時2個負峰在209和224 nm處出現，這表明無論超聲與否，zein都是典型的富含α-螺旋結構的蛋白質，此結果與之前的研究一致[22]。根據α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲結構的光譜數據，計算N-zein和超聲處理組的圓二色光譜的不同結構的占比，并進行蛋白質二級結構分析。表1展示了不同超聲條件下蛋白質二級結構的含量，經數據分析，N-zein的二級結構組成分別為45.5% α-螺旋、12% β-折疊、9.5%β-轉角和35.4%的無規則卷曲，這一結果與先前SELLING等[23]和ERICKSON等[16]研究結果一致，在體積分數80%的乙醇水溶液中，zein的α-螺旋含量在33.6%～60%，表明zein在醇水溶液中具有球狀結構。

圖2 不同超聲處理對玉米醇溶蛋白二級結構含量的影響Fig.2 Effect of different ultrasonic treatment on the secondary structure content of zein

表1 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白二級結構的相對含量 單位：%

如圖2和表1所示，當超聲強度較低時(U1～U3)，圖中曲線與對照組相比變化并不明顯，結構含量變化并不顯著，表明低強度的超聲波對zein的二級結構含量影響較小。值得注意的是，當超聲強度達到U4時，208和224 nm處的2個負峰強度上升，表明α-螺旋結構含量增加，由45.0%分別增加至58.0%和60.5%；同時，216 nm處的負峰強度也上升，這些現象表明，高強度超聲波導致β-折疊和β-轉角結構含量顯著降低，由數據分析可得，β-折疊從12.0%降低到3.5%，β-轉角含量也降低至3.6%，β-折疊含量的減少會降低蛋白質的柔韌性和擴展性，使zein分子結構更加具有剛性[24-25]；然而超聲波預處理對于zein結構中的無規則結構含量，作用不大。這些現象與REN等[22]的結果有所不同，其超聲波處理的zein三種結構含量均無明顯變化，可能是因為其超聲處理時的溶劑為水溶液，醇溶蛋白無法溶于水，導致超聲波無法影響其二級結構含量。

玉米醇溶蛋白二級結構含量的變化將會影響其自組裝的過程，由于自組裝主要是由zein受到溶劑極性的變化影響，其中α-螺旋結構自發變成β-折疊進行排列，后續多個長帶狀的zein進行卷曲形成球形納米顆粒[26]。因此，猜測當超聲波引起α-螺旋結構含量增加、β-折疊含量減少時，其形成納米顆粒的過程將會變慢，進而導致ZNP的粒徑受到影響。

2.1.3 粒徑及zeta電位

不同超聲波預處理對反溶劑法制備的ZNP溶液(pH 4.0)粒徑分布影響情況如圖3所示。可以發現經不同超聲波處理的ZNP粒徑分布均向左偏移，而且粒徑分布的寬度明顯變窄，這說明超聲波預處理使ZNP顆粒大小更為集中。其中經U1、U3超聲波處理的ZNP平均粒徑降低，但它的曲線寬度卻沒有變窄，分布甚至更加廣泛。

不同超聲條件下ZNP的平均粒徑、峰值粒徑、分散性指數和電位如表2所示。分散性指數(polydispersity index，PDI)通常用來反映顆粒的粒徑分布程度。發現超聲強度為U1時(230 W/cm2-20 min)，PDI增加，且顯著高于對照組，低強度超聲波雖然可以降低平均粒徑，但是對粒徑分布的集中均勻性沒有貢獻，甚至會使分布更加分散。隨著超聲時間增加(U2)，PDI降低，與對照組相比，顆粒變得更加均勻，說明相同超聲密度，延長超聲時間有利于PDI的降低，即有利于顆粒分布更加集中。而當超聲強度增加至460 W/cm2-20 min時，與U1條件具有相似的結果。當超聲強度進一步升高到達U4、U5時，PDI又繼續降低，證明了一定強度的超聲波可以促進玉米醇溶蛋白納米顆粒大小的均勻性，由此可以說明超聲波處理過程的超聲密度、超聲時間對顆粒均勻性有顯著的影響。這與REN等[22]的研究結果一致。

膠體顆粒溶液的穩定性主要取決于顆粒的粒度和表面所帶電荷量，粒徑小和電量高的顆粒溶液體系相對穩定。當zeta電位絕對值大于30 mV，膠體粒子可以借助其排斥靜電力來穩定乳液[29-30]。N-ZNP在溶液pH為4.0時，低于其等電點6.2，表面帶有正電荷，電位值為+26.4 mV。N-ZNP的zeta電位小于30 mV，說明溶液體系是不夠穩定的，容易產生沉淀。超聲波預處理使ZNP的電位絕對值顯著增加且均高于30 mV，也就是說對zein進行不同超聲波處理均能夠提高ZNP的溶液穩定性。相較于其他組，zein經U3預處理所形成的ZNP的zeta電位達到最高值(+40.9 mV)，此時的溶液穩定性最好。然后進一步增加超聲強度(U4、U5)，ZNP的zeta電位逐漸降低，由此可以得出，并非超聲波強度越大ZNP溶液越穩定。上述結果表明，超聲波預處理可以使ZNP粒徑降低并增加zeta電位絕對值，但其影響程度與影響規律受超聲強度和超聲時間影響。因此，為尋求最有利于ZNP在乳液穩定方面表現出更好性能的超聲條件，需要進一步分析。

圖3 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白粒徑及分布Fig.3 Size distribution of zein under different ultrasonic conditions

表2 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白粒徑、分散性指數及電位Table 2 Size PDI and potential of zein under different ultrasonic conditions

2.2 超聲波預處理對ZNP-FSG復合顆粒微觀形態和特性的影響

2.2.1 掃描電鏡觀察

ZNP與ZNP-FSG復合顆粒樣品微觀結構采用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)分別在放大倍數為1 000和8 000倍的條件下進行觀察，結果如圖4所示。ZNP在凍干后整體呈現片狀，結構緊密(圖4-a)。由于ZNP的粒徑較小，且機器放大倍數有限，放大至8 000倍時無法清晰呈現ZNP的球狀結構。隨著FSG的加入，ZNP-FSG復合顆粒凍干后整體呈細纖維狀，彼此交聯形成網絡結構(圖4-b)。當放大至8 000倍時可觀察到ZNP被包裹在FSG的內部顯現出圓形顆粒，說明FSG附著在ZNP的表面使粒徑變大，FSG的不平整性導致形成了粗糙的ZNP-FSG復合顆粒(圖4-c)。

a-N-ZNP(×1 000)；b-N-ZNP-FSG(×1 000)；c-N-ZNP-FSG(×8 000)圖4 玉米醇溶蛋白納米顆粒與玉米醇溶蛋白-亞麻膠 復合顆粒的SEM圖Fig.4 SEM of ZNP and ZNP-FSG composite particles

2.2.2 表面疏水性分析

當不同超聲波預處理的質量濃度10 mg/mL的ZNP溶液加入等量的質量濃度10 mg/mL的FSG溶液后，與未添加FSG的N-ZNP相比，U1組的表面疏水性沒有發生顯著變化，推測其原因可能是FSG主要通過靜電相互作用與ZNP結合，同時這2組ZNP電位值較低導致吸附的FSG數目較少，ZNP表面的疏水殘基并未受到影響。進一步增加超聲強度(U3∶460 W/cm2-20 min)和延長超聲時間(U2∶230 W/cm2-40 min)，ZNP的表面疏水性顯著性增強，兩者之間沒有顯著性差異。進一步對比發現，經更高強度的超聲波處理后(U4、U5)，ZNP的表面疏水性略低于處理條件為U2、U3時的表面疏水性。另外，對比發現，雖然超聲波預處理可以增加ZNP的表面疏水性，但是添加FSG形成ZNP-FSG復合顆粒后，其表面疏水性顯著下降，且不同超聲波預處理對復合顆粒的表面疏水性沒有顯著性影響。ZOU等[31]發現隨著親水性單寧酸的加入，ZNP表面疏水性顯著降低。推測ZNP表面疏水性顯著降低是由于其表面結合的FSG增加，但是FSG的加入是否同時遮蔽了原本由于超聲波預處理引起的ZNP的結構變化所帶來的影響，還需測量尺寸和電位來進一步確定其組間差異。

圖5 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白納米顆粒與玉米醇溶 蛋白-亞麻膠復合顆粒的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of ZNP and ZNP-FSG composite particles dispersion under different ultrasonic conditions

2.2.3 粒徑及zeta電位

不同超聲條件下ZNP-FSG復合顆粒的粒徑及分布如圖6所示，由于前處理過程中FSG溶液pH調節至4.0，可能導致FSG部分大分子裂解成較小的片斷無法與ZNP結合，所有實驗組都出現雙峰，分散性較差[32]。多糖的加入使ZNP粒徑增大，U4和U5粒徑增加的程度較弱，緊接著是U1和U2，U3處理組的粒徑最大且分布較廣泛，這一趨勢驗證了表面疏水性的結果。已有研究證明，zein與親水性多糖通過非共價相互作用：靜電、疏水與氫鍵作用生成復合顆粒[33-34]。表3列出了不同超聲條件預處理后的zein制備的ZNP-FSG復合顆粒的粒徑和zeta電位。由于與FSG的絡合，顆粒粒徑從193.5 nm增加到672 nm。ZNP被包裹后顆粒尺寸的增加可能部分是由于玉米蛋白和亞麻籽膠形成復合物，也有可能是因為多糖之間相互聚集所導致的[35]。與對照組相比，超聲處理組的復合顆粒粒徑顯著升高，從672 nm升至最高1 366 nm，證明更多的FSG成功附著在蛋白質表面；不同超聲處理組之間的粒徑存在明顯差距，代表其表面的多糖數量存在顯著差異。

由于ZNP與FSG在pH 4.0的水溶液里帶有正負2種電荷，當它們均勻分布在溶液中時，正負相吸而結合。靜電相互作用在蛋白質和陰離子多糖的形成復合物過程中及其穩定性程度起重要作用，決定其穩定性，并且，外部膠層決定著復合物顆粒的整體電荷特征[36]。無FSG包覆的天然ZNP的電位是+26.4 mV，經FSG包覆后電位變成負電荷，證明兩者主要由靜電相互作用形成具有較大粒徑的復合物，此結論可以通過表3的粒徑變化趨勢得到驗證。在超聲波預處理條件為U1時，ZNP-FSG復合顆粒的電位顯著降低至-36.9 mV，代表有部分多糖包裹在蛋白質表面，中和本身帶有的正電荷。隨著超聲處理強度增加，電位絕對值不斷升高。結合分析表2中超聲預波處理后ZNP所帶電荷數值，可以得出，ZNP所帶正電荷越多，結合陰離子多糖的能力越強，更多的負電荷亞麻籽膠包裹在表面，導致ZNP-FSG復合粒子表面負電荷量越高。由表3可知，超聲波預處理條件為U3時，ZNP在結合多糖后，其負電荷絕對值最高，達到40.6 mV。蛋白表面正電荷越高，結合FSG的能力就越強，同時也解釋了前文中ZNP-FSG復合粒子粒徑變化的可能原因。

綜上所述，針對不同超聲波條件下，ZNP-FSG復合顆粒的粒徑和電位的變化趨勢，發現超聲波預處理對zein的結構影響可以直接影響到ZNP和ZNP-FSG復合顆粒的結構、構象與顆粒大小，且變化趨勢與超聲波的超聲時間和超聲密度相關。證明超聲波預處理促進更多FSG附著在ZNP的表面，FSG作為親水性多糖可以進一步增加疏水性蛋白的表面親水性，使得ZNP-FSG復合顆粒同時擁有親水性蛋白質和膠體穩定性的特征，復合顆粒的理化性質對Pickering乳液的液滴粒徑分布及體系穩定性有著重要的意義。

圖6 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白-亞麻膠 復合顆粒的粒徑及分布Fig.6 Size and distribution of ZNP-FSG composite particles under different ultrasonic conditions

表3 不同超聲條件下玉米醇溶蛋白-亞麻膠 復合顆粒粒徑及電位Table 3 Size and potential of ZNP-FSG composite particles under different ultrasonic conditions

2.3 乳液性質及穩定性

2.3.1 乳液外觀及顯微鏡觀察

圖7-a展示了由水相與油相按體積比1∶1均質制備的乳液，可以觀察到除了N-ZNP，其他組均未出現分層現象，說明FSG在穩定乳液方面較強，與文獻報道一致[37]。質量濃度為5 mg/mL的N-ZNP穩定的乳液分層最嚴重，且底物出現絮凝物，由于玉米醇溶蛋白具有較強的疏水性，無法包裹油滴，只是單純與食用油混合。從每組乳液中間吸取一滴至載玻片上如圖7-b所示，液滴的外觀進一步展示了乳液的微觀特點，FSG組的液滴中間為乳液的形態，而周圍一圈呈現接近于透明的狀態；N-ZNP的液滴幾乎由油狀物構成，摻雜著些許蛋白質絮凝物；其他組的液滴都較為完整呈現乳白色，較為穩定。

乳液液滴放大4倍和40倍的光學顯微鏡圖(圖8)與液滴狀態描述的相一致，雖然FSG可以包裹油滴，但仍然有大量流動液體存在于液滴周圍，乳液狀態處在不穩定的邊緣；N-ZNP的顯微鏡圖中看不見任何液滴形態，食用油中漂浮著少許蛋白絮凝物；未經超聲復合顆粒組(N-ZNP-FSG)與超聲波預處理組(U-ZNP-FSG)復合顆粒制備的乳液都呈現完整視野的液滴，液滴大小較為集中，狀態良好，N-ZNP-FSG由于液滴尺寸較大，被蓋玻片擠壓輕微變形，且液滴分布較為松散。同時，與對照組相比，超聲組波的液滴尺寸更小，尤其是U2和U3組，形狀呈近圓形分布緊密，且尺寸大小較為集中。由倒置顯微鏡放大40倍后，發現不同超聲波預處理組間ZNP-FSG液滴大小有所差異，對照組、U1和U5組存在肉眼可見較大的液滴，U2和U3的狀態和尺寸相近，液滴比較密集，出現層次感。這說明經過一定條件的超聲波預處理的zein形成的ZNP-FSG乳液擁有較小的顆粒、較強的穩定性，具體尺寸分布仍需進一步測量分析。

a-Pickering乳液；b-液滴圖7 ZNP-FSG復合顆粒制備的Pickering乳液及液滴Fig.7 Visual observations of Pickering emulsion and droplets stabilized by ZNP-FSG composite particles

a-液滴放大4倍視野；b-液滴放大40倍視野圖8 ZNP-FSG復合顆粒制備的Pickering乳液照片 和光學顯微鏡圖Fig.8 Optical micrographs of Pickering emulsion stabilized by ZNP-FSG composite particles

2.3.2 液滴尺寸及分布

Pickering乳液的穩定性很大程度上決定于蛋白質顆粒的大小、分布、極性、微觀形貌等。前期研究發現，不同超聲波預處理形成的ZNP、ZNP-FSG復合顆粒的粒徑和表面電位等存在巨大差異(表3)，進而影響乳液的穩定性。不同超聲條件處理的復合顆粒對乳液液滴尺寸如圖9所示。隨著超聲處理的加入(U1)，所制備乳液的粒徑顯著減小，液滴粒徑從原來的76.8 μm降低至最35.8 μm左右,N-ZNP-FSG制備>的乳液液滴具有最大尺寸，其分布的峰較寬，與顯微鏡放大觀察到的現象一致。超聲波預處理組的ZNP-FSG粒徑分布變化趨勢與ZNP粒徑相似，均在U3-ZNP-FSG時獲得最小尺寸以及分布最集中。由此可以說明，在超聲條件為U3∶460 W/cm2-20 min時，ZNP包裹的FSG親水層較穩定，乳化性最強。WAN等[38]的研究表明，由SPI制備的乳液液滴越小其物理穩定性越強，因此可以推測出超聲處理組擁有較強的穩定性，不易出現分層。

圖9 不同超聲波預處理下的ZNP-FSG復合顆粒 制備乳液液滴粒徑分布Fig.9 Droplets size distribution of the Pickering emulsion made by ZNP-FSG composite particles under various ultrasonic treatment

此外，由于單獨FSG和ZNP穩定乳液中的油相已經大部分釋放，極其不穩定，所以不適合測量尺寸。分析其原因可能是ZNP對照組蛋白顆粒上的親水性多糖數量較低，親水面積較少無法包裹小油滴，導致油滴易發生聚集，粒徑較大。超聲波預處理增加了zein表面電荷絕對值，尤其是適宜超聲強度和時間下(U3)，ZNP-FSG復合物親水面積顯著增大，乳液滴粒徑減小，更加均一。與此同時，亞麻籽膠的黏稠性可以有效增加Pickering乳液連續相的黏度，有利于阻礙液滴間的碰撞和聚并，也阻止油滴的上浮或者水滴的沉降，延緩分層速度，增強了乳液的穩定性。

2.3.3 耐高溫穩定性

高溫環境可以加速乳液失穩，有利于短期內觀察復合物以及乳液的穩定性。熱處理可能會迫使蛋白質分子展開并暴露被埋藏的疏水基團，導致蛋白質與多糖之間發生反應并進一步形成復合物[18]。本文研究了在不添加任何物質的情況下，熱處理(80 ℃ 30 min)對Pickering乳液穩定性的影響，如圖10-a所示。在相對較高的溫度處理之后，將所有樣品倒置后僅FSG和N-ZNP組可以完全流動，其他組已經呈現凝膠狀態，這說明了ZNP-FSG復合顆粒經高溫處理后形成凝膠顆粒，使乳液流動性變差。

a-Pickering乳液正置與倒置；b-液滴放大4倍視野圖10 80 ℃水浴30 min之后乳液照片和光學顯微圖Fig.10 Visual observations and optical micrographs of emulsion after 80 ℃ water bath for 30 min

如圖10-b所示，對照組的乳液發生了顯著的變化，尤其由N-ZNP制備的乳液，經加熱后，油相與水相完全分離，蛋白質析出并漂浮在油相之中。同時，FSG的液滴直徑變大，油相析出。這種現象證明了醇溶蛋白的疏水性對于乳液體系是極其不利的，而FSG屬于大分子乳化劑，雖然同時具乳化能力和增稠性能，但是受到高溫影響后，原先穩定在油滴表面的部分FSG大分子容易脫落，導致乳液失穩,與陳海華[9]的研究結果一致。觀察ZNP-FSG復合顆粒制備的乳液，對比加熱前后顯微鏡下液滴的大小及分布，發現高溫處理后乳液液滴分布變得疏松，并且液滴尺寸有了一定增長，但大部分乳液,尤其是U3組,還保持著均一、較小的液滴，擁有較強穩定性,說明了一定強度超聲波預處理后,ZNP-FSG復合顆粒制備的乳液擁有抵抗高溫的物理穩定性。

3 結論

經過超聲波預處理的zein結構發生了顯著的變化，尤其是高強度超聲增加了α-螺旋結構的含量，同時使更多疏水性氨基酸暴露。超聲波預處理引起的zein的結構變化也使得反溶劑沉淀制備ZNP的過程受到影響，即適當的超聲波預處理條件可以顯著降低ZNP的平均粒徑、峰值粒徑，并增加電位絕對值，顯著提升體系穩定性。超聲波預處理進而影響了ZNP與FSG通過靜電相互作用形成的復合顆粒。超聲預處理促進了ZNP表面電位的升高，從而使得ZNP結合更多的FSG，導致復合顆粒的粒徑增大、電位絕對值增加，復合顆粒的親水性增加。最后經過熱穩定性分析結果，發現利用ZNP-FSG復合顆粒制備的乳液無分層析水現象，尤其U3下的液滴形態幾乎無變化，將其作為乳液穩定劑應用于需高溫處理的食品加工過程中，能夠有效地抵御液滴的聚集及破裂?？傊?，超聲波處理提供了一種提高Pickering粒子親水性以及穩定性，尤其是熱穩定性的物理改性方法。