玉米須多糖的乙醇沉淀分離及體內免疫調節作用研究

宮春宇，劉羽婷，單佳明，徐碩，邢悅

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(黑龍江省果蔬雜糧飲品工程技術研究中心，黑龍江 齊齊哈爾，161006)

玉米須(Stigmamaydis)是禾本科植物玉蜀黍ZeamaysL.的花柱和柱頭，是一種藥食兩用材料[1]。玉米須因具有豐富的生理功能，如降血糖、抗氧化、提高免疫力和利尿排毒[2-4]等，而受到廣泛關注。玉米須多糖是玉米須最重要的活性成分之一，具有含量高、功效廣泛等優點，但目前開發利用非常有限，這使得有關玉米須多糖的研究成為熱點。目前玉米須多糖的研究主要集中在粗多糖的制備方法，脫蛋白、脫色素[5-6]等領域，而關于玉米須多糖的體內功效研究相對比較薄弱。鄭鴻雁等[7]報道醇沉制備多糖可以提高小鼠抗體生成脾細胞數并一定程度上調節小鼠巨噬細胞的吞噬功能，但純化對玉米須多糖體內活性的影響尚未見報道。本研究分析了多糖純化中常采用的乙醇沉淀分離對玉米須多糖體內免疫活性的影響，為玉米須多糖的開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗原料

玉米須，安徽亳州中藥材批發市場，經清洗、烘干、粉碎備用。

1.1.2 主要試劑

膠原蛋白維生素C維生素E粉，湯臣倍健公司；小牛血清，分析純，北京博爾西科技有限公司；Giemsa染液、Hank’s液、阿氏液，分析純，北京博奧拓達科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 主要儀器

XSZ-G顯微鏡，上海儀圓顯微鏡公司；UF-20中空纖維超濾裝置，大城縣華泰凈化技術有限公司；722 N可見分光光度計，上海箐華科技儀器有限公司；PYX-DHS-500BS隔水電熱培養箱，北京市永光明醫療儀器廠。

1.1.4 實驗動物

昆明小鼠，長春市億斯實驗動物技術有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米須多糖制備

玉米須粉熱水煮沸2 h，3 000 r/min離心分離上清液，玉米須殘渣同法再提取一次，合并2次上清液，使用超濾膜分離小分子物質(分子質量<10 kDa)，收集超濾濃縮液，進一步濃縮后烘干至恒重，獲得玉米須超濾多糖(corn silk polysaccharide,CSP)，保存于干燥器中備用。

1.2.2 玉米須多糖乙醇沉淀分離

40%乙醇沉淀多糖(CSP-1)：將CSP研磨后制備成質量分數1.5%多糖溶液，向多糖液中加入無水乙醇至乙醇體積分數達到40%，4 ℃沉淀24 h，10 000 r/min離心20 min，分離上清液和沉淀，測量上清液體積用于后續實驗，沉淀烘干至恒重，即為CSP-1。

80%乙醇沉淀多糖(CSP-2)：向CSP-1分離得到的上清液中繼續加入無水乙醇至溶液乙醇體積分數達到80%，4 ℃沉淀24 h，4 000 r/min離心15 min，分離上清液和沉淀，將沉淀烘干至恒重，即為CSP-2。

上清多糖(CSP-3)：將從CSP-2分離得到上清液經旋轉蒸發濃縮后，烘干至恒重，即為CSP-3。各多糖得率按公式(1)計算：

(1)

1.2.3 玉米須多糖成分分析

多糖測定采用苯酚-硫酸法[8]；蛋白質測定采用凱氏定氮法[9]；總黃酮測定采用三氯化鋁分光光度法[10]。

1.2.4 體內免疫調節作用研究[11]

1.2.4.1 實驗動物

昆明小鼠體質量，18～22 g，雌雄各半，每組10只。

1.2.4.2 實驗多糖配制

設計14個實驗組：陰性對照組(蒸餾水)、陽性對照組(湯臣倍健膠原蛋白維生素C維生素E粉，500 mg/kg)、CSP、CSP-1、CSP-2和CSP-3的低、中、高劑量組(100、200、300 mg/kg)。玉米須多糖溶液經巴氏殺菌，冷卻至室溫后，用于灌胃，每只小鼠每天灌胃0.4 mL，實驗時間為30 d。

1.2.4.3 血清溶血素的測定

免疫動物及血清分離:用生理鹽水配成體積分數2%的綿羊紅細胞(sheep red blood cell,SRBC)懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL進行免疫，4～5 d后摘除眼球取血于離心管中，放置5 h，使血清充分析出，3 000 r/min離心15 min，分離血清，用于凝集實驗。

凝集反應:用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內，每孔100 μL，再加入100 μL體積分數0.5%的SRBC懸液，混勻，放入帶有濕潤紗布的平盤內，加蓋，于37 ℃溫箱孵育3 h，觀察血球凝集程度。

1.2.4.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(滴片法)

實驗前4～5 d給每只小鼠腹腔注射體積分數2%壓積SRBC 0.2 mL進行免疫，頸椎脫臼處死小鼠，每只小鼠腹腔注射含有體積分數5%小牛血清的Hank’s液4 mL，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后用注射器吸取腹腔洗液，取0.5 mL洗液加入盛有0.5 mL體積分數1%雞紅細胞懸液的離心管中，混勻。吸取0.5 mL混合液加入事先做好的載玻片瓊脂圈內。將載玻片放入帶有濕潤紗布的平盤中，放置于溫箱內37 ℃孵育15～20 min，孵育結束后迅速用生理鹽水將未貼壁細胞沖掉，加入甲醇固定10 min，再用Giemsa液染色15 min，用蒸餾水沖洗干凈，晾干。在10×40倍顯微鏡下觀察巨噬細胞吞噬雞紅細胞情況，計數。

吞噬率為每100個巨噬細胞中，吞噬雞紅細胞的巨噬細胞所占的百分率按公式(2)計算；吞噬指數為平均每個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的個數按公式(3)計算:

(2)

(3)

1.2.4.5 免疫器官指數的測定

剖解小鼠，取脾臟、胸腺、腦、肝、腎、心臟和肺并稱取質量，按公式(4)計算臟器指數。

臟器指數=臟器質量(mg)/體質量(g)

(4)

1.2.5 數據統計分析

使用 Excel 2010 軟件對數據進行處理，SPSS 17.0軟件進行統計分析。Duncan法進行多組樣本間差異顯著性分析，LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 玉米須多糖組成分析

超濾法制備的玉米須多糖CSP(復溶率為95.2%)經不同體積分數乙醇沉淀分離后，獲得3個多糖組分CSP-1、CSP-2和CSP-3，得率分別為23.01%、41.41%和28.02%，其中CSP-2得率遠高于其他2個多糖。它們的多糖含量基本相當，其中CSP-2和CSP-3略高。3個組分的多糖絕對含量(指各組分多糖的得率與其多糖含量之積)之和為32.03%，和初始母多糖CSP相近(35.43%)，其中CSP-2絕對多糖含量最高為14.68%，占到CSP的41.43%，其次是CSP-3為10.05%，占28.37%，CSP-1最少為7.29%，占20.58%。綜上分析，可見玉米須超濾多糖主要為不溶于體積分數80%乙醇的高分子量多糖，占多糖總量的近一半。同時CSP-2中蛋白質含量是3個組分中最低的，可見高濃度乙醇沉淀可以有效降低玉米須多糖中蛋白質含量，可能有利于后續純化。體積分數80%乙醇沉淀多糖時沉淀物成絮狀，4 000 r/min 離心即可，且離心后沉淀結實，容易與上清液分離；而體積分數40%乙醇沉淀多糖時，沉淀物顆粒較小，需10 000 r/min離心，離心后沉淀不結實，但可以與上清液較好地分離，沉淀成泥狀。

表1 不同玉米須多糖組成成分Table 1 Component analysis different corn silk polysaccharides

2.2 玉米須多糖對小鼠血清溶血素的影響

溶血素是一種體液免疫物質。由表2可知，4種玉米須多糖的3個實驗劑量組小鼠產生的抗體都明顯高于陰性對照組，說明實驗效果顯著，4種玉米須多糖都可以提高小鼠血清中抗體的產生量，具有激活體液免疫能力[11]。通過組內比較發現，CSP低、中、高劑量組之間抗體水平無顯著差異，表明CSP對小鼠體液免疫的激活作用沒有劑量依賴性，只需100 mg/kg玉米須多糖，即可達到激活體液免疫作用。但在另一個同類型實驗中，發現CSP低劑量時表現出劑量依賴性，與本實驗結果有一定出入，但也僅限于低濃度是否有劑量依賴性上，不影響對其提高體液免疫能力的判斷。CSP-1中和高劑量明顯優于低劑量，可見其低濃度時呈現劑量依賴性，但繼續升高濃度到300 mg/kg對活性沒有明顯提升作用。CSP-2 低劑量活性優于中和高劑量，說明其只需較低濃度即可發揮激活體液免疫的作用，但濃度過高反而會使活性降低，可能是由于其含有一定的起負面效應的物質，當濃度升高時，其對多糖的綜合效果影響增大，導致整體活性下降。隨著濃度的升高,CSP-3的活性先升高后降低，最佳的濃度是200 mg/kg。在組間活性表現上，CSP和CSP-1的所有實驗劑量組都優于陽性對照組，CSP-2的低劑量和CSP-3的中劑量組優于陽性對照組，其他劑量與陽性對照組活性相當，表明CSP和CSP-1對小鼠體液免疫的激活作用優于市售具有提高免疫功能保健食品的效果，CSP-2和CSP-3不遜于市售陽性保健食品的效果；相同劑量比較，CSP-1至少有2個劑量抗體水平高于CSP-2和CSP-3，表明CSP純化后的3個組分中活性最好的是CSP-1，其活性與CSP相當。

表2 小鼠血清溶血素生成量Table 2 Yields of serum emolysin with different polysaccharides

2.3 玉米須多糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬作用影響

巨噬細胞在細胞免疫中發揮重要作用。由表3可知，經灌胃后，CSP 三個劑量、CSP-1中、高劑量和CSP-2 三個實驗劑量的巨噬細胞吞噬指數明顯高于陰性對照組，表明CSP、CSP-1和CSP-2可提高小鼠巨噬細胞的吞噬指數(P<0.05)，依據“保健食品檢驗與評價技術規范(2003版)”[11]結果判定原則(實驗組中任意2個劑量陽性，可判定該功能測定實驗陽性)，具有提高細胞免疫功能活性。CSP-3沒有提高細胞免疫功能活性。組內比較中，發現CSP高劑量組活性優于低、中劑量組，表明對小鼠巨噬細胞的激活作用，在濃度達到200 mg/kg以上時具有劑量依賴性。但在另一個同類型實驗中，發現CSP低劑量時(200 mg/kg以下)表現出劑量依賴性，與本實驗結果有一定出入，但2次實驗都證實CSP有提高細胞免疫功能活性，僅在不同濃度間活性表現不一致，后續實驗將進一步驗證。CSP-1的活性呈現劑量依賴性，隨著濃度升高，活性提高。CSP-2 低和中劑量活性優于高劑量，表明其只需較低濃度即可發揮激活體液免疫的作用，但濃度過高(達到300 mg/kg時)反而會使活性降低。在組間活性表現上，CSP的所有實驗劑量都與陽性對照組相當，CSP-1的高劑量組優于陽性，中和低劑量與陽性相當，而CSP-2的低和中劑量組優于陽性，高劑量組和陽性相當，說明CSP-2對小鼠細胞免疫功能的激活作用優于市售宣稱具有提高免疫功能的保健食品和前體多糖CSP，而CSP-1與陽性對照相當。可見經乙醇沉淀純化后CSP-2的調節細胞免疫功能得到強化和提升。

表3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗結果Table 3 Results of phagocytosis of chicken red blood cells by mouse peritoneal macrophages.

2.4 玉米須多糖對小鼠免疫器官的影響

胸腺和脾臟作為重要的免疫器官，其器官質量及臟器指數可一定程度上反映機體免疫功能的強弱。由表4可見，體內灌胃30 d后，4種玉米須多糖和陽性對照可明顯提升脾臟指數，表明它們可以促進小鼠脾臟生長。組內和組間比較發現，除CSP中劑量組和CSP-3低劑量組的脾指數明顯升高外，其他實驗組間沒有差異，因此初步認為4種多糖和陽性保健食品對小鼠脾臟的生長促進作用無顯著差異。對于胸腺指數，除CSP-2中和高劑量組沒有明顯升高外，其他多糖至少有2個劑量組有明顯升高，表明CSP、CSP-1、CSP-3和市售保健食品對小鼠胸腺的生長有明顯促進作用，但CSP-2沒有促進作用。CSP、CSP-1、CSP-3和陽性對照比較，分別都有2個劑量組沒表現出差異。表明CSP、CSP-1、CSP-3和陽性保健食品對小鼠胸腺的生長促進作用沒有明顯差異。

2.5 玉米須多糖對小鼠其他主要器官的影響

CSP、CSP-1、CSP-2和CSP-3對小鼠其他主要器官生長的影響研究發現，它們和陽性保健食品對心臟、腎、肺、肝和腦的生長沒有顯著影響(相關數據略)。

表4 玉米須多糖對小鼠胸腺和脾臟的影響Table 4 Effects of polysaccharide from Stigma maydis on thymus and spleen in mice

3 結論

研究發現采用超濾法制備的玉米須多糖(CSP)主要為不溶于體積分數80%乙醇的高分子量多糖(CSP-2)，占多糖總量的近一半。小鼠體內免疫活性實驗結果顯示，多糖CSP、CSP-1和CSP-2在細胞免疫功能和體液免疫功能實驗中均為陽性，可判定3種多糖具有調節免疫功能作用[11]，其中CSP-1表現出劑量依賴性，CSP-2在低濃度時活性更佳，且3種多糖對體液免疫功能調節作用優于陽性對照市售保健食品；幾種多糖間比較發現CSP-1調節體液免疫功能優于CSP-2和CSP-3，與CSP相當，而CSP-2對細胞免疫功能的調劑作用明顯優于CSP和市售保健品(陽性對照)，可見經純化后80%乙醇沉淀級分的調節細胞免疫功能得到強化和提升。同時發現，CSP、CSP-1和CSP-3可促進脾臟和胸腺生長，3種多糖作用效果沒有明顯差異和市售保健食品相當，而CSP-2只對小鼠脾臟的生長具有促進作用，幾種實驗多糖對小鼠心臟、腎、肺、肝和腦的生長沒有顯著影響。