玉米蛋白水解物免疫活性的研究

高健,林巍,劉曉蘭,劉祥,鄭喜群,李冠龍

1(齊齊哈爾大學 食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 2(黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾，161006) 3(黑龍江八一農墾大學 食品學院，黑龍江 大慶，163319)

隨著人類對食品功能性認識的不斷深入，“食品”不僅僅是傳統意義上供人類食用或飲用以滿足人類果腹的物品，更承擔起改善人體亞健康、調節人體機能的作用。研究發現，許多谷物蛋白來源的肽具有良好的免疫活性，不僅可以促進淋巴細胞分化成熟、轉移免疫信息、增強機體免疫機能，還可以增強巨噬細胞吞噬能力，進而提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發病率[1]。劉劍利等[2]研究發現小米多肽可以刺激小鼠的淋巴細胞轉化，且在灌胃劑量為500和1 000 mg/(kg·d)時，半數溶血值(half hemolytic concentration,HC50)和巨噬細胞吞噬能力與對照組有顯著差異(P<0.01)，表明小米多肽可以調節小鼠免疫能力；代卉等[3]發現小麥肽可以調節環磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫及抗氧化功能，發現100 mg/(kg·d)的小麥肽可以緩解免疫抑制小鼠應激狀態所引起的機體抗氧化體系紊亂及免疫功能的降低，提高抗體生成細胞含量和腹腔巨噬細胞吞噬能力；刁靜靜等[4]研究發現,小分子綠豆肽在質量濃度為200 mg/mL時具有促進巨噬細胞的增殖、上調巨噬細胞中細胞因子表達量等功能，免疫效果良好。

玉米蛋白粉是玉米濕法生產淀粉的副產物，其蛋白質含量在60%以上，主要為醇溶蛋白(68%)[5]，但水溶性差、氣味特殊等特點限制了其在食品領域的應用。玉米蛋白的多肽鏈存在多個功能區，具有抗氧化[6]、降血壓[7]、抗疲勞[8]、抗腫瘤[9]、促乙醇代謝及護肝[10]等多種生物活性，但目前關于玉米蛋白水解物(corn gluten hydrolysate，CGH)的研究主要集中于其抗氧化活性及護肝作用，其他活性研究尚需開展，尤其是其免疫調節活性。玉米蛋白粉含有豐富的疏水性氨基酸，且其水解物具有良好的抗氧化活性[11-13]，而目前大量關于免疫活性的研究發現，免疫活性物質通常具有疏水性氨基酸[14]，且同時有著很好的抗氧化活性。朱科學等[15]研究發現，菠蘿蜜多糖可以提高正常小鼠脾淋巴細胞的抗氧化及免疫功能，可顯著促進脾淋巴細胞抗腫瘤因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的分泌；王君巧等[16]研究發現，黑靈芝多糖可以拮抗環磷酰胺對小鼠免疫功能的抑制作用，提高TNF-α含量和IL-2含量，還可提高免疫抑制小鼠的抗氧化功能，提升脾組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和降低丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)含量；包曉瑋等[17]發現甜菜紅素對正常小鼠體內抗氧化能力及免疫功能具有調節作用，可以提高小鼠血清中SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的含量，降低MDA的含量，還可以提高正常小鼠脾淋巴細胞增值能力、血清溶血素和自然殺傷(natural killer,NK)細胞活性。

本文以玉米蛋白粉為研究對象，預處理后通過雙酶分步水解獲得CGH，研究CGH體外脾淋巴細胞增殖活性，以及其對免疫抑制小鼠免疫調節作用的影響，為CGH在食品保健及醫藥領域的應用和玉米蛋白粉的深入開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米蛋白粉，黑龍江龍鳳玉米開發有限公司；α-淀粉酶，北京奧博星生物技術責任有限公司；復合蛋白酶、堿性蛋白酶，丹麥諾維信公司；RPMI-1640培養基，Gibico公司；胎牛血清，BI公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide DMSO)、紅細胞裂解液，索萊寶公司；刀豆球蛋白A(concanavalin，Con A)，BBI公司；Hank’s液、3-(4,5-二甲基-2噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT)，上海生工生物工程有限公司；清潔級ICR小鼠(20±2)g，春億斯實驗動物技術有限責任公司[生產許可證為SCXK(吉)-2019-0004]；環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)，江蘇盛迪醫藥有限公司； SOD、GSH-Px、CAT、MDA、TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6 ELISA試劑盒，上海江萊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PC/PLC-LD-53冷凍干燥機，美國MILLROCK公司；TCL-16G型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；CT15RE型高速冷凍離心機，天美科學儀器有限公司；DF-1型集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰公司；SX-500高溫蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司；DynamicaV 14R高速離心機，澳大利亞Dynamica公司；EnSpire多功能酶標儀，珀金埃爾默股份有限公司。

1.3 CGH制備

參考本課題組前期已經確定的方法[18]。稱取一定量的去淀粉預處理后的玉米蛋白粉，用50 mmol/L pH 7.0的Tris-HCl緩沖液配制成質量濃度為100 g/L的玉米蛋白懸浮液，用復合蛋白酶和堿性蛋白酶分步水解。復合蛋白酶[酶解條件：加酶量2.5%(質量分數)、pH 7.0、溫度50 ℃]酶解3 h后用2 mol/L NaOH溶液調pH至8.5，加入堿性蛋白酶。堿性蛋白酶[酶解條件：加酶量2.5%(質量分數)、pH 8.5、溫度60 ℃]酶解2.5 h后將酶解液于沸水中滅酶15 min，于3 000 r/min離心20 min，取上清液得到CGH。水解過程中使用1 mol/L NaOH溶液保持2種酶反應體系pH的恒定。將得到的CGH進行納濾脫鹽，冷凍干燥后備用。

1.4 體外培養脾淋巴細胞增殖實驗

1.4.1 脾淋巴細胞懸液的制備

將正常飼喂的小鼠引頸處死后，用體積分數為75%的乙醇浸泡10 min，將小鼠置于平皿中，在超凈臺上獲取脾臟，剪去脂肪和多余的筋膜，用鑷子將脾在盛有適量無菌Hank，s液的平皿中撕碎研磨，制成脾細胞懸液。200目篩網過濾后按照紅細胞裂解液說明書加入裂解液2～3次，每次室溫放置3 min后，1 000 r/min離心5 min去除紅細胞，得到單細胞懸液。將此細胞懸液用磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，每次1 000 r/min離心5 min，重懸于RPMI-1640完全培養基中，置于 37 ℃、5% CO2培養箱中，培養2 h，去除貼壁細胞后即為脾淋巴細胞懸液，臺盼藍染色計數，活細胞數在95%以上。

1.4.2 體外脾淋巴細胞增殖的測定

制備密度為5×106個/mL脾淋巴細胞懸液，接種于96孔板中。設置對照孔(100 μL細胞懸液+100 μL RPMI-1640培養基)、Con A孔(100 μL細胞懸液+100 μL Con A RPMI-1640溶液，調整Con A終質量濃度為5 μg/mL)、實驗孔(100 μL細胞懸液+100 μL CGH RPMI-1640溶液，調整CGH終質量濃度為20、40、80、160和320 μg/mL)，每組設6個復孔，設置3個平行實驗。將上述孔板置于無菌室中，在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養48 h，培養結束前4 h每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續培養4 h。培養結束后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO溶液溶解 MTT作用活細胞所產生的甲瓚沉淀，使用微孔板振蕩儀于37 ℃振蕩混勻10 min，待紫色沉淀完全溶解后用酶聯免疫檢測儀檢測各孔在570 nm波長處的吸光度A570。

1.5 動物實驗分組及給藥方法

ICR雌性小鼠60只，適應性生長4 d后，隨機分為5組：正常對照組、CTX模型組、CTX+CGH低劑量組、CTX+CGH中劑量組和CTX+CGH高劑量組。其中，正常對照組和CTX模型組灌胃生理鹽水，CTX+CGH低劑量組、CTX+CGH中劑量組和CTX+CGH高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/(kg·d)的CGH溶液，每日定時灌胃1次，連續21 d。5組均正常攝食攝水，按1只小鼠4～8 g喂食，且在處死前禁食不禁水12 h。第21 天時，CTX模型組、CTX+CGH低劑量組、CTX+CGH中劑量組和CTX+CGH高劑量組腹腔注射200 mg/(kg·d)的CTX，正常對照組腹腔注射等量生理鹽水，5組均于24 h后處死。

1.6 免疫抑制小鼠血清中細胞因子水平的測定

各組小鼠分別眼球取血，室溫靜置過夜析出血清，于4 ℃，3 000 r/min離心10 min分離血清，收集血清于2 mL Eppendorf管中，-80 ℃保存備用。將各組血清解凍后，嚴格按照TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6的ELISA試劑盒說明書進行操作，測定免疫抑制小鼠血清中細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6水平。

1.7 免疫抑制小鼠體內抗氧化活性的測定

將各組血清解凍后，嚴格按SOD、GSH-Px、CAT和MDA的ELISA試劑盒說明書進行操作，測定免疫抑制小鼠血清中SOD、GSH-Px、CAT和MDA水平。

1.8 統計學處理

實驗數據以平均值±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 CGH對體外脾淋巴細胞增殖的影響

脾淋巴細胞體外增殖實驗結果如圖1所示，結果表明，脾淋巴細胞增殖率隨著CGH質量濃度的增加而增加，呈劑量依賴性，CGH終質量濃度在80～320 μg/mL時，與對照組(終質量濃度為0 μg/mL)相比差異顯著(P<0.05)，且質量濃度在80 μg/mL時，與質量濃度為5 μg/mL的Con A無顯著差異(P>0.05)，質量濃度在320 μg/mL時,脾淋巴細胞增殖率提高至192.16%，促增殖效果良好。

圖1 CGH對體外脾淋巴細胞增殖的影響Fig.1 Effects of CGH on proliferation of spleen lymphocytes in vitro 注:不同小寫字母表示樣本間差異有統計學意義(P<0.05)(下同)

2.2 CGH對免疫抑制小鼠血清中細胞因子的影響

CGH對免疫抑制小鼠血清中細胞因子的影響如圖2所示，CTX模型組TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6含量與正常對照組相比均顯著降低(P<0.05)，說明CTX對免疫調節網絡造成破壞，打破小鼠體內免疫系統的平衡，各項細胞因子均大幅下降，小鼠的免疫功能被抑制，建模效果良好。

a-TNF-α;b-IFN-γ;c-IL-2;d-IL-6圖2 CGH對免疫抑制小鼠血清中細胞因子的影響Fig.2 Effect of CGH on serum cytokines in immunosuppressed mice

CGH對免疫抑制小鼠血清中TNF-α的影響如圖2-a所示，CTX+CGH低、中、高劑量組TNF-α含量與模型組相比顯著提高(P<0.05)，且隨著CGH質量濃度的增加TNF-α含量增高，其中CTX+CGH高劑量組血清中TNF-α含量較模型組提高1.44倍，為(488.24±77.06)pg/mL。

CGH對免疫抑制小鼠血清中IFN-γ的影響如圖2-b所示，CTX+CGH低、中、高劑量組IFN-γ含量與模型組相比顯著提高(P<0.05)，高劑量CGH使免疫抑制小鼠IFN-γ含量由(408.46±65.18)pg/mL提高至(602.01±71.05)pg/mL。

CGH對免疫抑制小鼠血清中IL-2的影響如圖2-c所示，CTX+CGH中、高劑量組IL-2含量與模型組相比顯著提高(P<0.05)，由模型組的(186.53±25.72)pg/mL分別提高至(226.50±26.99)、(227.66±30.48)pg/mL，CTX+CGH低劑量組IL-2含量與模型組無顯著性差異(P>0.05)。

CGH對免疫抑制小鼠血清中IL-6的影響如圖2-d所示，CTX+CGH高劑量組IL-6含量與模型組相比顯著提高(P<0.05)，提高了1.30倍，而CTX+CGH低劑量組、CTX+CGH中劑量組IL-6含量與模型組無顯著差異(P>0.05)。

2.3 CGH對免疫抑制小鼠體內抗氧化活性的影響

機體的抗氧化能力與免疫功能關系密切，抗氧化能力的強弱對維持機體的健康有著重要作用。正常生理狀態時，自由基不斷產生，并通過SOD和GSH-Px不斷清除，處于動態平衡[19-20]，當對機體注射CTX后，CTX可以打破這種平衡，引起機體的氧化應激[21]。在體內實驗中，檢測抗氧化關鍵酶SOD、GSH-Px、CAT和脂質過氧化產物MDA可以反映CGH的體內抗氧化水平，結果如圖3所示。

a-SOD;b-GSH-Px;c-CAT;d-MDA圖3 CGH對免疫抑制小鼠體內抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of CGH on antioxidant activity in immunosuppressed mice

CGH對免疫抑制小鼠血清中SOD的影響如圖3-a所示，CTX模型組血清中SOD含量與正常對照組相比顯著降低(P<0.05)，其中CTX模型組血清中SOD含量為(5.04±0.84)ng/mL，較對照組降低1.60倍，SOD含量的顯著降低表明CTX會引起體內超氧自由基富集，說明CTX會損傷免疫細胞，影響機體正常免疫反應的進行。CTX+CGH中、高劑量組SOD含量與模型組相比顯著提高(P<0.05)，CTX+CGH低劑量組的SOD含量與模型組無顯著差異(P>0.05)。

CGH對免疫抑制小鼠血清中GSH-Px的影響如圖3-b所示，CTX模型組血清中GSH-Px含量與正常對照組相比顯著降低(P<0.05)，由(147.80±19.49)ng/mL降低至(103.23±15.21)ng/mL，體內GSH-Px含量的減少說明CTX會影響有毒過氧化物的分解，從而對免疫細胞產生毒副作用，抑制機體正常的免疫功能。CTX+CGH中、高劑量組GSH-Px含量與模型組相比顯著提高(P<0.05)，分別較模型組提高1.21倍和1.41倍，CTX+CGH低劑量組GSH-Px含量與模型組無顯著差異(P>0.05)，CTX+CGH高劑量組GSH-Px含量與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)。

CGH對免疫抑制小鼠血清中CAT的影響如圖3-c所示，CTX模型組血清中CAT含量與正常對照組相比顯著降低(P<0.05)，腹腔注射CTX后，CAT含量會迅速下降，由(946.61±69.41)pg/mL降低至(568.86±46.54)pg/mL，使細胞受到過量H2O2的毒害，同樣對機體的免疫系統造成損壞。CTX+CGH低、中和高劑量組CAT含量與模型組相比均顯著提高(P<0.05)。

CGH對免疫抑制小鼠血清中MDA的影響如圖3-d所示，CTX模型組血清中MDA含量與正常對照組相比顯著升高(P<0.05)，CTX注射后，血清中MDA含量提高1.39倍，這些過量的MDA會通過多種途徑對細胞尤其是免疫細胞造成損傷，還會對機體的免疫功能產生抑制作用。CTX+CGH中、高劑量組MDA含量與模型組相比顯著降低(P<0.05)，CTX+CGH高劑量組降低至(16.67±1.81)nmol/mL，與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)，CTX+CGH低劑量組MDA含量與模型組無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

脾臟是機體內形體最大的淋巴器官，脾的內部分為白髓和紅髓，表皮則有一層結締組織形成的被膜，脾淋巴細胞主要聚集在白髓中，脾淋巴細胞中含有T淋巴細胞和B淋巴細胞，均是機體的免疫活性細胞，免疫細胞的活化是免疫細胞參與免疫的重要體現[22]。免疫細胞在活化后有不同的表現，T淋巴細胞活化的重要表現之一就是T淋巴細胞的分裂增殖及分化，所以T淋巴細胞的增殖率是反映細胞免疫最直接的指標。本實驗研究結果表明，與Con A陽性對照組相比，160 μg/mL的CGH能更好的促進脾淋巴細胞體外分裂增殖及分化，推斷CGH可作為淋巴細胞的有絲分裂原,促進淋巴細胞增殖，進而發揮其免疫增強活性，對增強機體的免疫功能具有重要的意義。

細胞因子是一類由多種免疫細胞和一些非免疫細胞分泌的，最終作用于細胞的多肽、小分子蛋白或糖蛋白，能參與并調節機體免疫應答、細胞分化、造血、腫瘤免疫等多種生理及病理過程[23]。本實驗選取淋巴細胞產生的IFN-γ、IL-2以及單核細胞或巨噬細胞產生的TNF-α和IL-6作為研究指標。TNF-α是血清中一種能使腫瘤發生出血性壞死的物質，主要來源于各種免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞，TNF-α在生物學上應用廣泛，不僅有對腫瘤細胞造成損傷、強化中性粒細胞的吞噬能力，還可以增加過氧化物陰離子產生，刺激細胞脫顆粒和分泌髓過氧化物酶、抗感染，并誘導肝細胞急性期蛋白的合成[24]，CGH低中高劑量時均可顯著提高免疫抑制小鼠的TNF-α含量。IFN-γ為Ⅱ型干擾素，主要由活化的T淋巴細胞和NK細胞產生，IFN-γ可通過激活單核吞噬細胞殺滅微生物及腫瘤細胞，激活中性粒細胞和NK細胞，強化NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性，促進巨噬細胞的吞噬功能，抑制自分泌生長因子的形成和活性，抑制宿主向腫瘤細胞提供重要的營養因子或生長因子，從而造成腫瘤細胞的凋亡[25]，CGH低中高劑量時均可顯著提高免疫抑制小鼠IFN-γ的含量。IL-2能刺激T輔助細胞和NK細胞產生細胞因子,促進細胞因子的繁殖以及刺激T細胞在體外生長等功能[26]，CGH中高劑量時均顯著提高免疫抑制小鼠IL-2的含量。IL-6在多種細胞功能調節方面具有重要的作用，包括細胞分化、增殖、免疫防御、造血功能、神經系統等，IL-6與腫瘤細胞的生長、增殖密切相關，通過對腫瘤細胞的黏附性、活動力、增殖以及特異性抗原的表達，控制腫瘤的發展[27]，CGH高劑量時可顯著提高免疫抑制小鼠IL-6的含量。結果表明，CGH高劑量時可顯著促進免疫抑制小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6含量的提高，拮抗CTX對小鼠免疫功能的抑制作用。

抗氧化與免疫之間有著密切的聯系[3,14-16]，自由基的過量失控也會對機體免疫系統造成損傷。免疫細胞和免疫器官對氧化應激十分敏感[28]。實驗結果表明，CTX使小鼠血清中脂質過氧化物MDA含量增高，此時小鼠體內自由基過量，可損害機體的免疫組織和免疫細胞，還可作用于免疫和淋巴系統，降低了機體細胞免疫和體液免疫，引起機體免疫功能的損傷[29]，而CGH可通過提高小鼠體內抗氧化酶的活性緩解CTX對機體的侵害。CGH體內抗氧化活性研究結果顯示，CGH提高了免疫抑制小鼠體內抗氧化酶活性，在劑量為200 [mg/(kg·d)]時，血清中GSH-Px與MDA含量與正常對照組無顯著差異，表現出良好的體內抗氧化能力，說明CGH可有效的提高免疫抑制小鼠體內抗氧化水平，提高小鼠體內抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的含量，并減少脂質過氧化產物MDA的生成量，保護細胞免受MDA的毒副作用，緩解CTX對機體的氧化損傷。

4 結論

綜上所述，復合蛋白酶和堿性蛋白酶協同水解制備的CGH可以促進脾淋巴細胞的體外增殖，質量濃度在320 μg/mL時，脾淋巴細胞增殖率提高至192.16%，緩解了CTX導致的免疫抑制作用，CGH高劑量時可有效提高免疫抑制小鼠血清中細胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6的含量，提高了免疫抑制小鼠體內抗氧化活性，提高了抗氧化酶SOD、GSH-Px和CAT的含量，降低了免疫抑制小鼠體內MDA的含量，增強了小鼠免疫調節能力，從而保護機體健康。除此以外，CGH還具有易制備的優點，更利于實際應用，因而在玉米深加工領域具有廣闊的應用前景。