采用GC-O-MS結合香氣活力值分析蘭陵美酒香氣活性組分特征

樊杉杉，管桂坤，蘇雅芝，萬自然，劉明坤，王濤，郭一民，徐巖， 范文來*，陳雙*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 釀造微生物與應用酶學實驗室，江蘇 無錫,214122) 3(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫,214122) 4(山東蘭陵美酒股份有限公司，山東 臨沂,276000)

蘭陵美酒是我國歷史傳統名酒之一，釀制歷史可追溯到殷商時代，距今已有3000多年歷史。蘭陵美酒以北方黍米為原料，采用雙邊發酵的傳統方法，在麥曲和酵母的作用下進行前酵，之后將其注入瓷缸進行后酵，以完善風味使其綿柔醇厚，物質平衡，半年后啟缸[1]。其酒體呈琥珀光澤，晶瑩明澈，保有原料和發酵產生的天然混合香氣，濃郁襲人，具有怡人的風味。

黃酒獨特的口感和香氣決定了感官評價與風味鑒定結果，是衡量黃酒質量的重要因素之一，也是帶領和吸引消費者的重要因素之一。目前已有研究對不同的黃酒香氣組分進行解析，王麗華等[2]利用氣相色譜-聞香(gas chromatography-olfactometry, GC-O)方法分析得到了黃酒中比較重要的11種化合物。江偉等[3]對黃酒中34種重要香氣物質進行了定量分析，并比較了這些物質在不同年份黃酒中的差異和變化規律。羅濤等[4]利用頂空固相微萃取技術(headspace solid phase microextraction, HS-SPME)結合氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrum, GC-MS)對黃酒樣品進行分析，并對其中的54種物質進行了定量分析[4]。CHEN等[5-7]利用分子感官科學對江浙地區的古越龍山黃酒特征香氣進行了解析，隨后利用香氣萃取稀釋分析(aroma extract dilution analysis, AEDA)結合香氣活力值(odor activity value, OAV)比較了傳統型和現代型黃酒的風味差異，之后又對新釀和陳釀古越龍山黃酒的香氣成分進行了比較，研究表明葫蘆巴內酯、香蘭素、3-甲基丁醛和苯甲醛對陳年黃酒的整體香氣起關鍵作用。

黃酒一般是以糧食谷物等為釀造原料，經過多種微生物發酵而成的低酒精度飲品[8]。黃酒香氣成分復雜，而且各地區釀制黃酒時所采用的原料、酵母、水源和采用的技術也不盡相同，因此給予了黃酒不一樣的風味特征。目前，尚未見對以黍米為釀造原料的北方蘭陵美酒中香氣活性組分的研究報道，其風味化學特征還缺乏系統的研究，對風味特征的主要化學物質還不明晰。而蘭陵美酒的風味特征不僅決定著其風味與品質，對其生產工藝、微生物體系等起著重要的反向調控作用，因此有必要對蘭陵美酒的風味特征進行研究。

本課題以蘭陵美酒為研究對象，采用感官分析對蘭陵美酒進行感官評價得到其風味輪廓圖；通過HS-SPME和液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)對風味物質進行萃取分離，采用GC-O-MS確定香氣組分；采用HS-SPME和液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)結合GC-MS的全定量方法，對蘭陵美酒進行定量分析及OAV值計算，解析香氣活性組分。本文研究對了解蘭陵美酒香氣成分的形成機理，實現風味導向蘭陵美酒釀造技術的開發，穩定產品品質具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要儀器

GC 6890N-MSD 5975氣相色譜質譜聯用儀，美國安捷倫公司；ODP 2聞香儀、多功能自動進樣器，德國Gerstel公司；DC-12氮吹儀，上海安譜實驗科技股份有限公司；Millipore-Q超純水系統，美國密理博公司。

1.1.2 主要試劑

色譜純： CH2Cl2，百靈威科技有限公司；無水乙醇，上海安譜科學儀器公司，C5～C30正構烷烴標準品、化合物定性及定量時所用標準品，Sigma-Aldrich 公司；

分析純： Na2SO4、 NaCl、2 mol/L H2SO4溶液、0.1 mol/L NaOH標準溶液，上海國藥集團。實驗用水均為煮沸 5 min 后冷卻至室溫的超純水。

1.1.3 實驗材料

蘭陵美酒樣品，山東蘭陵美酒股份有限公司，乙醇體積分數為12%，屬于半甜型黃酒。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘭陵美酒香氣輪廓圖的構建

參照文獻的方法[9]，挑選12位品評員進行為期3個月共3輪的感官訓練。在第1輪的訓練中，品評員需要對將近30種不同氣味標準品進行聞香并熟悉其香氣特征；第2輪訓練中，品評員以黃酒風味為基礎對蘭陵美酒樣品多次嗅聞并進行香氣描述詞的收集，最終經過討論篩選出7個重要的香氣描述詞；第3輪的訓練中，針對這7個香氣描述詞配制不同濃度的參比樣進行香氣強度訓練，對品評員的香氣強度打分進行矯正。最后，這些品評員對從蘭陵黃酒中篩選出的7個主要香氣描述詞進行打分(10分制，0表示沒有聞到該香氣，1～3強度較弱，4～6中等，7～10較強)。最終結果取所有品評員結果的平均值，并繪制蘭陵美酒香氣輪廓圖。

1.2.2 蘭陵美酒香氣組分解析

蘭陵美酒樣品中香氣組分的解析參照陳雙等[10]報道的方法進行了部分調整。具體分析過程如下：

HS-SPME提取揮發性組分：稱取1.5 g NaCl，量取5 mL樣品于頂空瓶中，用帶PTFE/藍色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封。使用多功能自動進樣系統進行HS-SPME。萃取過程如下：采用2 cm 50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，萃取溫度50 ℃，樣品平衡時間5 min，萃取時間50 min，乳化器轉速500 r/min。萃取結束后將萃取頭置于GC進樣口在250 ℃下解吸附5 min，進行GC-MS檢測分析。

LLE提取揮發性組分：取250 mL酒樣加入NaCl至飽和，用CH2Cl2在分液漏斗中萃取3次(每次50 mL)，合并有機相記為萃取相Ⅰ。加150 mL超純水到萃取相Ⅰ中，再用配制好的0.1 mol/L NaOH溶液調節pH至9，用分液漏斗分層，上層水相記為萃取相Ⅱ,有機相記為萃取相Ⅲ(中堿性組分記為NBF)，隨后用2 mol/L的H2SO4溶液調節萃取相Ⅱ的pH為2，用CH2Cl2在分液漏斗中萃取3次(每次25 mL)，合并有機相得到萃取組分Ⅵ(酸性組分記為AF)。NBF、AF均加入適量的無水Na2SO4(呈流沙狀即可)置于-20 ℃下干燥過夜。氮吹濃縮至500 μL。

GC-O-MS解析揮發性香氣組分：氣相色譜-質譜儀串聯聞香裝置用于GC-O-MS分析。

GC條件：進樣口與檢測器溫度均為250 ℃，載氣為高純He，流速為1 mL/min，進樣模式為不分流進樣，色譜柱采用DB-FFAP (60 m×0.32 mm,0.25 μm)。升溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min后，以6 ℃/min的速度升溫至230 ℃，保持15 min。

MS條件：以EI電離源為離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35.00～350.00 amu。

GC-O方法：挑選2名經過訓練，熟悉各種香氣描述的聞香員，分別對經過HS-SPME的酒樣和LLE后的中堿性組分(NBF)和酸性組分(AF)進行時間-強度法的聞香，每個樣品嗅聞2次。每個香氣物質的香氣強度為2人嗅聞12次的平均值。

1.2.3 蘭陵美酒香氣活性組分解析

HS-SPME-GC-MS定量香氣組分：針對大部分香氣強度高于2.0的香氣組分利用HS-SPME-GC-MS進行定量分析。吸取一定量的各香氣組分標準品，加入到體積分數10% 的乙醇中制成混合標準母液，并進行梯度稀釋(以2為梯度稀釋倍數)，一共10個點，且各類標準品分開配制。在每個梯度的標準樣品和酒樣中分別加入40 μL的叔戊酸內標(1197.10 μg/L)和其他混合內標[2-辛醇(294.08 μg/L)、L-薄荷醇(680 μg/L)、乙酸-2-苯乙酯-D3(146.34 μg/L)、辛酸乙酯-D15(70.83 μg/L)、正己醇-D13(322.66 μg/L)、2-甲氧基-苯酚-D3(307.37 μg/L)和乙酸-L-薄荷酯(12.17 μg/L)]。在與1.2.2小節的相同條件下進行HS-SPME-GC-MS解析，通過計算各組分與內標峰面積和質量濃度的比值構建各香氣組分的定量標準曲線，從而計算酒樣中各香氣物質的含量。

LLME-GC-MS定量香氣組分：針對極性較大的酸類物質和HS-SPME回歸方程不滿足要求的物質利用LLME-GC-MS進行定量分析。分別吸取40 mL不同梯度濃度的標品混合液和酒樣到60 mL樣品瓶中，加入320 μL的叔戊酸內標(1 197.10 μg/L)和320 μL其他混合內標，用CH2Cl2萃取3次(每次2 mL)，合并有機相后進行冷凍干燥并氮吹濃縮至500 μL。在與1.2.2小節的相同條件下進行GC-MS解析，通過計算各組分與內標峰面積和質量濃度的比值構建各香氣組分的定量標準曲線，從而計算酒樣中各香氣物質的含量。

香氣活性組分確定：OAV值為各物質在樣品中的含量與其在樣品基質下閾值的比值，以此來評價該物質在酒樣整體香氣中的貢獻程度。其中OAV > 1的物質被認為對香氣有貢獻，OAV > 10的香氣物質被認為對酒樣的香氣有重大貢獻[11]。

2 結果與討論

2.1 蘭陵美酒香氣輪廓圖

采用感官訓練的方法，確定了蘭陵美酒的7個香氣描述詞，分別為花果香、蜂蜜、醇香、焦糖、米香、酸香和醬香。在第3輪的訓練中，配制香氣描述詞對應的香氣參比樣進行感官訓練。參照王棟等[9]的方法，選取不同濃度的香氣參比樣進行訓練，強度描述分別為：0表示沒有聞到該香氣，1～3強度較弱，4～6中等，7～10較強。各香氣描述詞及對應參照物為：花果香(己酸乙酯)、蜂蜜(苯甲酸乙酯)、醇香(乙醇)、焦糖(葫蘆巴內酯)、米香(2-甲基吡嗪)、酸香(乙酸)和醬香(醬油)。經過一段時間的香氣強度標準訓練，培訓品評小組成員樣品區分能力、重復性及一致性均較好，接著品評員對蘭陵美酒的7個香氣屬性進行了香氣強度的打分，根據打分的結果，制成了蘭陵美酒的香氣輪廓圖。由圖1可知，蘭陵美酒具有強烈的醬香，香氣強度打分達7.2，酸香和焦糖香氣強度也較大，分別為5.1和4.9；具有中等的米香，香氣強度為3.6；醇香、蜂蜜、花果香較弱，香氣強度分別為2.0、1.9、1.8。與其他發酵酒(葡萄酒、啤酒)相比，醬香是蘭陵美酒所特有的香氣特征描述詞。

圖1 蘭陵美酒香氣輪廓特征Fig.1 Sensory profile of Lanling Meijiu.

2.2 蘭陵美酒中香氣化合物的鑒定

對蘭陵美酒進行GC-O-MS解析，其結果如表1所示。根據質譜比對，保留指數比較，香氣描述詞確定共鑒定出50種香氣化合物，最主要的物質是酯類、醇類和酸類。對其平均香氣強度進行計算發現，其中香氣較為突出的有乙酸異戊酯(香蕉，3.0)，己酸乙酯(果香，4.0)，庚酸乙酯(果香，2.6)，丁二酸二乙酯(花果香，2.8)，異戊醇 (指甲油，3.0)和苯甲醛(杏仁，3.0)。此研究在蘭陵美酒中檢測到了一些新物質對香氣有貢獻，如煙酸乙酯(玫瑰、梔子，1.8)，5-羥甲基糠醛(杏仁、堅果，2.0)。

表1 蘭陵美酒GC-O-MS聞香結果Table 1 Results of GC-O-MS of Lanling Meijiu.

續表1

各類物質的香氣強度比例如圖2。可以直觀地看出，酯類物質香氣強度最大，這和目前文獻報道的結論相同。其次，醛類、醇類和酸類香氣強度的百分比之和為38%，是貢獻香氣的第2大物質類群。酚類、吡嗪類、呋喃類、酮類和內酯類香氣強度百分比之和為17%，對香氣的貢獻率較少。但綜合來看，具有香氣貢獻的物質種類達10種之多，更加解釋了蘭陵美酒香氣十分復雜。

圖2 蘭陵美酒中不同種類化合物香氣強度百分比Fig.2 Percentage of aroma intensity of different compounds in Lanling Meijiu.

酯類化合物：通過GC-O-MS解析可確定的酯類物質有15種，其中比較重要的酯類物質有乙酸乙酯(果香、指甲油，3.0)、丁酸乙酯(甜香、果香，2.4)、乙酸異戊酯(香蕉，3.0)、戊酸乙酯(甜香、果香，2.5)、己酸乙酯(果香，4.0)、庚酸乙酯(果香，2.6)、辛酸乙酯(甜香、果香，2.5)、丁二酸二乙酯(花果香，2.8)和乙酸苯乙酯(花香，2.5)。

醇類化合物：通過GC-O-MS可檢測到的醇類物質共有8種，其中香氣強度較大的有正丁醇(酒香，2.5)、異戊醇 (指甲油，3.0)、苯甲醇(花香，2.1)和苯乙醇(蜂蜜，2.2)。

酸類化合物：通過GC-O-MS可檢測到酸類物質共有5種，其中香氣強度較大的有戊酸(酸，2.3)和庚酸(脂肪，2.5)。俗話說“無酸不成酒”，酸是酒精飲料中重要的協調成分和呈味物質，是酒精飲料中的骨架成分[12]，可以與其他物質共同作用生成芳香物質，適量的酸賦予酒體協調的口感，同時賦予酒體一定的緩沖能力[13]。

醛酮類化合物：蘭陵酒樣中共檢測到醛酮類物質11種，包括苯甲醛、苯乙醛、5-甲基呋喃醛、2-苯基巴豆醛，其中香氣貢獻較大的有苯甲醛(苦杏仁，3.0)、苯乙醛(玫瑰，2.5)和香蘭素(香草，2.5)。酮類物質香氣平均強度值較低，如3-羥基-2-丁酮(奶油，1.5)。

其他類化合物：共檢測到呋喃類化合物4種，2(5H)-呋喃酮、5-羥甲基糠醛、糠醛和2-正丁基呋喃，香氣值較大的有5-羥甲基糠醛(杏仁，2.0)和糠醛(焦糖，2.5)。GC-O聞香結果可知，呋喃類化合物一般具有杏仁和焦糖的香氣，屬于黃酒香氣的一類重要的呈香物質。本研究檢測到2種吡嗪類化合物(2,3,5-三甲基吡嗪和2,3,5,6-四甲基吡嗪)的香氣值均為2.5，對香氣有比較突出的貢獻，具有瓜子、果香的香氣。近年來關注到的對黃酒有香氣貢獻的香蘭素和香草酸乙酯也被檢測到，其香氣強度分別為2.5和2.3，由于香氣強度值是存在于空氣中的感官值，具有強烈的主觀性，其具體風味貢獻還需結合OAV值的大小來確定。

2.3 蘭陵美酒香氣物質含量及OAV值分析

GC-O是定位食品中香氣物質的有效工具，但這并不能說明這些物質對食品整個香氣輪廓的最終結果。主要因為在GC-O分析中，化合物在嗅聞之前被分離和濃縮，但在實際樣品中，只有濃度高于樣品基質下氣味閾值的香氣物質才對整體香氣有貢獻。此外，乙醇含量對香氣化合物的揮發性具有重要影響[14]。因此，利用OAV 值可以表征香氣組分在黃酒基質中的香氣貢獻[15]。在OAV值計算中，通過構建標準曲線，對蘭陵美酒中香氣強度高于2.0的香氣組分進行了定量。所定量的香氣物質標準曲線線性良好，決定系數(R2)均在0.99以上，同一樣品平行3次實驗的RSD低于10%，定量方法精確。定量結果表明，蘭陵美酒中異戊醇(109 422.52 μg/L)、乙酸乙酯(43 598.05 μg/L)和苯乙醇(47 868.11 μg/L)的質量濃度較高(> 45 000 μg/L)。

為了進一步解析這些香氣組分對蘭陵美酒總體香氣特征的貢獻，對其進行OAV計算。如表2所示，共有12個物質OAV > 1(圖3)，分別為乙酸乙酯(OAV=3.55)、丁酸乙酯(OAV=38.10)、戊酸乙酯(OAV=1.15)、己酸乙酯(OAV=29.98)、辛酸乙酯(OAV=2.60)、異戊醇(OAV=3.65)、苯乙醇(OAV=5.63)、苯甲醛(OAV=4.66)、苯乙醛(OAV=6.54)、香蘭素(OAV=50.73)、γ-壬內酯(OAV=1.61)和4-乙烯基愈創木酚(OAV=3.22)，說明這些香氣物質對蘭陵美酒香氣輪廓有重要貢獻。其中，酯類物質是由酸和醇經過酯化反應形成的，主要發生在酒精發酵過程中，在相關酶的催化作用下，酰基輔酶A及脂肪酸和醇類反應生成，主要包括2類：乙基酯和乙酸酯[16]。酯類物質主要呈現果香和花香，在酒精飲料中酯類物質的含量一般不是很高，但因為有其他物質的存在，酯類物質的香氣會有所強化[17]，進而對酒體的整個香氣的結構和特點產生影響[18]。醇類物質中OAV較高的是異戊醇和苯乙醇，醇類物質可使酒體醇厚豐滿，回味綿甜，同時也是酯類化合物的前驅物質[19]，該類化合物主要來自發酵過程中有氧條件下糖的轉化及無氧條件下氨基酸的轉化而形成[20]。苯甲醛和苯乙醛是蘭陵美酒中重要的醛類化合物，分別為蘭陵美酒的感官特征貢獻了苦杏仁和玫瑰香。苯乙醛閾值較低為25 μg/L，來源于苯丙氨酸的降解[21]，是發酵酒中的重要的香氣化合物。香蘭素是蘭陵美酒中OAV值最高的香氣物質，有研究表明，阿魏酸可在微生物的作用下轉化為香蘭素[22]，而黃酒釀造中所使用的麥曲等原料中含有豐富的阿魏酸，這可能是蘭陵美酒中香蘭素的主要來源。

表2 蘭陵美酒中香氣活性化合物的含量及其香氣活力值Table 2 Contents of aroma compounds in Lanling Meijiu

圖3 蘭陵美酒關鍵香氣化合物結構及香氣特征Fig.3 Potent aroma-active compounds (OAVs>1) in Lanling Meijiu

3 結論

本文以蘭陵美酒為研究對象，通過科學的感官分析，構建了其香氣輪廓圖，結果表明蘭陵美酒的醬香、花果香、醇香和焦糖香比較突出。采用HS-SPME和LLE前處理方法結合GC-O-MS共解析出50種香氣組分，其中香氣強度較大的有乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、丁二酸二乙酯、異戊醇和苯甲醛。進一步通過內標法建立標準曲線對這些香氣組分進行定量和OAV值計算，結果表明對蘭陵美酒整體香氣特征具有重要貢獻的關鍵香氣物質有12種，分別為乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、異戊醇、苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、香蘭素、γ-壬內酯和4-乙烯基愈創木酚。本研究科學解析了蘭陵美酒中關鍵香氣物質的種類、含量及其香氣貢獻特征，對于科學認識蘭陵美酒香氣特征的風味化學本質和產品風味品質控制具有一定的理論意義。