氣質(zhì)聯(lián)用結(jié)合多元分析法比較甜橙汁與寬皮柑橘汁的香氣成分差異

周琦，易鑫，歐陽(yáng)祝，李俊杰，馮雨，李貴節(jié)，談安群，黃林華，王華

(西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶，400712)

柑橘屬(Citrus)為蕓香科植物，種植面積和產(chǎn)量在我國(guó)均位列第一，常見種類主要有甜橙、寬皮柑橘、柚和檸檬四大類。寬皮柑橘(Citrusreticulata)是一類果皮寬松，汁多肉粒飽滿的柑橘品種。甜橙(Citrussinensis)是一類果皮稍難剝離但果肉飽滿，汁多且味道甜酸可口的柑橘品種。隨著國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)變化以及柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展，我國(guó)的柑橘品種結(jié)構(gòu)嚴(yán)重失調(diào)，寬皮柑橘占了柑橘總產(chǎn)量的70%～80%，雖然我國(guó)已開始對(duì)柑橘種植品種結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整，但2017年我國(guó)寬皮柑橘和甜橙的產(chǎn)量分別為1 818.77和868.58萬(wàn)t，各占當(dāng)年主要柑橘種類產(chǎn)量的52%和25%[1]，可見寬皮柑橘仍然是我國(guó)產(chǎn)量最大的柑橘品種[2]。

非濃縮還原 (not from concentrate, NFC)柑橘汁因極大限度地保存原汁的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，逐漸成為廣大消費(fèi)者最喜愛的果蔬汁飲品之一[3]。國(guó)際上NFC柑橘汁主要以甜橙汁為主，寬皮柑橘汁占比極小，因?yàn)橄M(fèi)者普遍認(rèn)為甜橙汁的香味優(yōu)于寬皮柑橘汁。基于此，國(guó)內(nèi)外研究者進(jìn)行了有關(guān)實(shí)驗(yàn)分析甜橙汁與寬皮柑橘汁香氣物質(zhì)的差異。FENG等[4]采用GC-MS對(duì)瓦倫西亞橙和LB8-9寬皮柑橘的香氣成分進(jìn)行測(cè)定，并采用香氣活度值(odor active value，OAV)計(jì)算特征香氣，發(fā)現(xiàn)瓦倫西亞橙中酯類和醛類物質(zhì)含量要明顯高于LB8-9寬皮柑橘。成傳香等[5]通過GC-MS測(cè)定了3種寬皮柑橘汁和7種甜橙汁中的香氣成分，發(fā)現(xiàn)寬皮柑橘汁中的香氣物質(zhì)種類和含量要低于大部分甜橙。REN等[6]采用GC-MS分別對(duì)6個(gè)柑橘品種的香氣成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)甜橙和蜜橘中萜類化合物存在含量差異，且萜類化合物在兩類柑橘的香氣物質(zhì)中含量最高。香氣是影響柑橘加工制品品質(zhì)最重要的因素之一[7]，且受不同因素的影響[8]。目前國(guó)內(nèi)外的研究表明甜橙汁和寬皮柑橘汁中的香氣成分存在差異性，但研究中涉及的柑橘品種、品系均較少，且缺乏對(duì)柑橘種類間具體香氣差異研究[4, 9-10]。

我國(guó)柑橘汁生產(chǎn)目前是以甜橙為主，但由于寬皮柑橘產(chǎn)量遠(yuǎn)高于甜橙，存在鮮銷困難[11]，未來(lái)寬皮柑橘汁產(chǎn)量會(huì)大大提高。本研究以16種中國(guó)主栽甜橙和寬皮柑橘為研究對(duì)象，模擬工業(yè)中柑橘汁的生產(chǎn)進(jìn)行榨汁，利用GC-MS結(jié)合主成分分析比較兩大類柑橘汁香氣成分的具體差異，進(jìn)一步在香氣物質(zhì)方面為寬皮柑橘制汁提供數(shù)據(jù)支撐，從而提高我國(guó)寬皮柑橘利用率，緩解鮮果滯銷難題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成熟甜橙果實(shí)和寬皮柑橘果實(shí)采自中國(guó)江津(東經(jīng)106°16′、北緯29°18′)、中國(guó)忠縣(東經(jīng)108°02′、北緯30°30′)的柑橘園和西南大學(xué)柑桔研究所國(guó)家果樹種植柑橘資源圃(東經(jīng) 106°43′、北緯29°83′)，其中兩類柑橘各8種，均覆蓋多個(gè)品系，共計(jì)16種。樣品信息見表1。

表1 柑橘樣品信息Table 1 Information of citrus samples

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甲醇、C5～C25正構(gòu)烷烴，色譜純，美國(guó)Honeywell公司；環(huán)己酮(濃度>99.5%)，色譜純，上海aladdin公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQP十萬(wàn)分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；H-100-DWBWIA01原汁機(jī)，惠人新生活文化傳媒有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 7890 GC-5977 MSD，配備30 m×0.25 mm，0.25 μm 的DB-5MS石英毛細(xì)管色譜柱)，美國(guó)Agilent公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭(DVB/CAR/PDMS)，美國(guó)Supelco公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理及樣品制備

柑橘汁的制備：采摘新鮮成熟的果實(shí)，去皮榨汁，經(jīng)過100目紗網(wǎng)精濾，裝瓶備用。

待測(cè)樣品的前處理[12]：取5 mL搖勻后的柑橘汁于 20 mL螺口萃取瓶中，準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)物3 μL(采用甲醇稀釋40倍的環(huán)己酮，質(zhì)量濃度14.25 μg/mL)，在萃取瓶頂空充氮20 s后封蓋，40 ℃平衡 20 min，插入SPME萃取頭，使其纖維頭暴露在萃取瓶頂空恒定深度30 min，230 ℃上機(jī)解析 5 min。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)條件

GC-MS升溫程序[13]：起始溫度35 ℃，保持0 min；再以7 ℃/min 升至98 ℃；接著以3 ℃/min升至161 ℃，最后以10 ℃/min升至241 ℃；進(jìn)樣口溫度230 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣(He)流速1.2 mL/min。

EI離子源；電子能量70 eV;傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z40～350。

1.3.3 樣品香氣物質(zhì)的定性與定量分析

香氣物質(zhì)的定性分析：各樣品的香氣成分采用安捷倫系統(tǒng)圖譜庫(kù)(W10 N14.L)匹配、并且以C5～C25正構(gòu)烷烴保留時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算保留指數(shù)(retention index, RI)與已知RI[14]相結(jié)合的方式進(jìn)行定性。

香氣物質(zhì)的定量分析：參考SHUI等[15]的方法進(jìn)行修改，并選取稀釋后的環(huán)己酮為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，采用內(nèi)標(biāo)法半定量。樣品柑橘汁中香氣物質(zhì)含量按公式(1)計(jì)算[13]：

(1)

式中：ρ待,待測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，μg/mL；S待,待測(cè)物質(zhì)的峰面積；ρ,環(huán)己酮的密度,0.95 g/mL；V1,樣品中加入環(huán)己酮的體積,mL；S1,環(huán)己酮的峰面積；V待,樣品的體積,5 mL。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

氣相色譜分析采用Qualitative Workflows B.08.00和Data Analysis；數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0、The Unscrambler X 10.4和Microsoft Excel 365；圖片處理采用Origin 2018；所有樣品平行實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果采用平均數(shù)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 主栽甜橙汁與寬皮柑橘汁總離子流圖

對(duì)中國(guó)主栽的8種甜橙和8種寬皮柑橘果汁中香氣物質(zhì)的種類和含量進(jìn)行了測(cè)定，采用RI結(jié)合質(zhì)譜定性；其中質(zhì)譜庫(kù)匹配度均高于90%，計(jì)算得到的RI與實(shí)驗(yàn)得到的RI相差在0.5%以內(nèi)，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確性。選取典型甜橙汁與寬皮柑橘為代表品種，即奧林達(dá)夏橙和新生系3號(hào)椪柑，其總離子流圖如圖1所示。甜橙汁與寬皮柑橘汁存在大量相同保留時(shí)間的物質(zhì)，但其含量存在明顯的差異，且兩類果汁中含量最高的香氣物質(zhì)均為D-檸檬烯。此外，兩類柑橘汁色譜圖中還存在部分香氣物質(zhì)的種類不同，主要的差異集中在Area 1(保留時(shí)間：7.6～12.0 min，RI：901～1 081)和Area 2(保留時(shí)間：22.5.6～30.0 min，RI：1 387～1 586)兩個(gè)保留時(shí)間段。其中Area 1主要是單萜類化合物和少量低碳醇醛流出，Area 2主要是倍半萜類化合物和少量碳原子數(shù)較大的化合物流出。這可能是由于單萜類和倍半萜類這兩類化合物都是以異戊二烯(C5H8)n為結(jié)構(gòu)單元[6]，其各自種類的分子式相同，但分子結(jié)構(gòu)存在細(xì)微差異致使分子極性不同[16]，所以導(dǎo)致了保留時(shí)間相對(duì)集中但又各自分離。

a-奧林達(dá)甜橙汁；b-新生系3號(hào)椪柑汁圖1 典型甜橙汁與寬皮柑橘汁的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of typical sweet orange juice and mandarin juice

2.2 甜橙汁與寬皮柑橘汁中特有的香氣物質(zhì)

柑橘汁的香味是多種揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds, VOCs)混合后的綜合表現(xiàn)，不同種類的VOCs對(duì)香味的貢獻(xiàn)不同[17]。16種柑橘汁經(jīng)前處理后通過GC-MS測(cè)定，檢出單萜類化合物12種，倍半萜類化合物18種，醇類化合物14種，醛類化合物13種，酮類化合物7種，酯類化合物11種以及2種其他類化合物，共計(jì)77種揮發(fā)性有機(jī)物。

甜橙汁和寬皮柑橘汁特有的香氣物質(zhì)信息(去除共同含有的香氣物質(zhì))如表2所示，在8種甜橙汁樣品中檢測(cè)出來(lái)了14種特有香氣物質(zhì)，包含倍半萜類3種、醇類3種、醛類2種、酮類2種及酯類6種；8種寬皮柑橘汁樣品中共檢測(cè)出7種特有的香氣物質(zhì)，包含單萜類1種、倍半萜類2種、醛類1種、酮類2種及其他類1種。其中甜橙汁與寬皮柑橘汁中特有的萜類、醛類和酮類化合物種類數(shù)量相當(dāng)，但甜橙汁含有寬皮柑橘汁中不存在的3種醇類和6種酯類物質(zhì)，而醇類和酯類是極為重要的兩類香氣物質(zhì)[18]，這也在一定程度上體現(xiàn)出甜橙汁的綜合香氣要優(yōu)于寬皮柑橘汁。而寬皮柑橘汁中檢出1種名為百里酚的其他類揮發(fā)性有機(jī)物，其存在于大部分寬皮柑橘汁中，甜橙汁中不含有該物質(zhì)。此外，甜橙汁和寬皮柑橘汁特有的香氣物質(zhì)可以作為區(qū)分兩者的一個(gè)重要指標(biāo)。

2.3 甜橙汁與寬皮柑橘汁香氣物質(zhì)種類及含量的比較

通過將香氣物質(zhì)進(jìn)行分類，甜橙汁和寬皮柑橘汁的香氣物質(zhì)分類匯總?cè)绫?所示。萜類化合物(單萜類和倍半萜類)在所有的柑橘品種中種類數(shù)量和含量均是最高的，可以占香氣物質(zhì)總量的60%以上，與已有研究結(jié)果相吻合[19-20]。埃及橘(2-1)的單萜類化合物含量遠(yuǎn)高于其他品種，達(dá)1 037.78 μg/mL，占比達(dá)到87%，但其倍半萜類化合物的種類和含量卻低于大部分其他柑橘品種。此外，甜橙汁和寬皮柑橘汁中單萜類化合物含量差異不顯著(P>0.05)，但甜橙汁中的倍半萜類化合物含量遠(yuǎn)高于寬皮柑橘汁(P<0.01)。柑橘汁中的醇類物質(zhì)含量?jī)H次于萜類化合物，由表3可知甜橙汁和寬皮柑橘汁中的醇類物質(zhì)雖然含量差異不顯著(P>0.05)，但甜橙汁中醇類物質(zhì)的種類數(shù)量普遍高于寬皮柑橘汁。所有的甜橙和寬皮柑橘汁樣品中醛類和其他類別化合物在含量上差異不顯著，但其酮類化合物和酯類化合物含量差異顯著(P<0.01)，且甜橙汁中酯類物質(zhì)的種類遠(yuǎn)多于寬皮柑橘汁，這也與表2的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。

表2 甜橙汁和寬皮柑橘汁特有的香氣物質(zhì)信息Table 2 Information of unique aromas in sweet orange juice and mandarin juice

表3 甜橙汁與寬皮柑橘汁香氣物質(zhì)分類匯總表 單位：μg/mL

2.4 甜橙汁和寬皮柑橘汁特征香氣成分的比較

柑橘汁中存在部分含量高的香氣成分，但其香氣強(qiáng)度及其對(duì)總體香氣的貢獻(xiàn)不一定高，比如D-檸檬烯。通常認(rèn)為，樣品中的主體香氣僅由一部分香氣物質(zhì)參與構(gòu)建[21]，并將 OAV>1的香氣物質(zhì)定義為對(duì)樣品香氣有顯著貢獻(xiàn)，被稱為特征香氣成分或主體香氣成分[22]，且OAV值越高，該香氣成分對(duì)樣品香氣的整體貢獻(xiàn)也就越大。陳光靜等[23]認(rèn)為OAV>500的香氣物質(zhì)對(duì)樣品香氣會(huì)產(chǎn)生極顯著的影響。通過GC-MS結(jié)合內(nèi)標(biāo)法對(duì)樣品香氣物質(zhì)定量，并結(jié)合文獻(xiàn)[24-27]及書籍[28-29]查詢各物質(zhì)香氣閾值，計(jì)算篩選出16種柑橘汁樣品特征香氣及其OAV值見表4。

由表4可知，16種柑橘汁中共有47種特征香氣成分，其中單萜類11種、倍半萜類2種、醇類10種、醛類12種、酮類5種、酯類6種、其他成分1種。在47種特征香氣中，兩類柑橘汁的α-蒎烯、α-萜品油烯和香茅醇的OAV值都普遍大于100，芳樟醇、正己醛、壬醛的OAV值甚至達(dá)到了1 000以上，可認(rèn)為這些香氣物質(zhì)對(duì)兩類柑橘汁的主體香氣貢獻(xiàn)極大，且在兩類柑橘汁中芳樟醇的含量在醇類物質(zhì)中是最高的，這也與SHUI等[15]研究結(jié)果相似。同時(shí),甜橙汁中的β-月桂烯OAV值顯著高于寬皮柑橘汁，而寬皮柑橘汁中的γ-松油烯顯著高于甜橙汁，這說明β-月桂烯和γ-松油烯分別對(duì)甜橙汁和寬皮柑橘汁的主體香氣貢獻(xiàn)較大。α-紫羅酮是甜橙汁的特有香氣物質(zhì)，甲基庚烯酮是寬皮柑橘汁的特有香氣物質(zhì)，兩者分別對(duì)甜橙汁和寬皮柑橘汁的主體香氣起較大的作用。

此外，2-辛烯醛只在長(zhǎng)葉香橙(1-1)和云貴橙(1-2)中檢出，且OAV值較高，其他柑橘品種不存在該物質(zhì)，可認(rèn)為2-辛烯醛是長(zhǎng)葉香橙(1-1)和云貴橙(1-2)特有的、對(duì)主體香氣貢獻(xiàn)較大的物質(zhì)。α-檸檬醛、十一醛和十二醛也只在少數(shù)柑橘品種中檢出，但這3種物質(zhì)在寬皮柑橘值中的OAV值大于甜橙汁。辛酸乙酯、正己酸乙酯、丁酸乙酯和3-羥基己酸乙酯的OAV值極高，且這5種物質(zhì)只在甜橙汁中檢出，是甜橙的特有香氣物質(zhì)，這也從另一方面解釋了寬皮柑橘汁的總體風(fēng)味不如甜橙汁的原因，與表2的結(jié)果相吻合。

2.5 主成分分析

為進(jìn)一步從整體上比較甜橙汁和寬皮柑橘汁香氣物質(zhì)的差異性，選取了兩類柑橘特有的香氣物質(zhì)及部分共有的但含量差異明顯的物質(zhì)(共計(jì)31種)，以8種甜橙汁和8種寬皮柑橘汁為分析對(duì)象，采用主成分分析對(duì)目標(biāo)香氣物質(zhì)的含量進(jìn)行分析，結(jié)果分別如圖2和圖3所示。由三維分值圖(圖2)可知，甜橙汁和寬皮柑橘汁的樣品點(diǎn)在PC-1和PC-2二維平面上分別匯聚成2個(gè)獨(dú)立的集合，可明顯區(qū)分開。由相關(guān)性載荷圖(圖3)可知，β-月桂烯、順式-2,8-薄荷二烯-1-醇、反式-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)環(huán)己-2-烯-1-醇、反式香芹醇、順式香芹醇、L-香芹酮和反式醋酸肉桂酯在PC-2上的相關(guān)分量達(dá)到了0.6～0.8，即這些物質(zhì)在PC-1和PC-2二維平面上對(duì) X-和Y-方向有較大貢獻(xiàn)。甜橙汁與寬皮柑橘汁在圖2上樣品點(diǎn)的分布與圖3中兩組香氣物質(zhì)的分布相吻合，即上述的兩組香氣物質(zhì)分別對(duì)甜橙汁和寬皮柑橘汁有較大的的貢獻(xiàn)，可以認(rèn)為這兩組香氣物質(zhì)是區(qū)分兩類柑橘汁的重要指標(biāo)。同時(shí)，結(jié)合表4可知，埃及橘(2-1)和南豐蜜橘(2-5)中β-蒎烯[30]、γ-松油烯[31]和百里酚的OAV值與其他寬皮柑橘相比較有所不同，這也解釋了為什么埃及橘(2-1)和南豐蜜橘(2-5)距離其他寬皮柑橘樣品距離較遠(yuǎn)且在三維分值圖中偏向PC-1和PC-2平面的第4象限。此外，對(duì)甜橙汁風(fēng)味(X-和Y-方向)有貢獻(xiàn)的香氣物質(zhì)主要是酯類和醇類，這也和寬皮柑橘汁中酯類和醇類香氣物質(zhì)的種類和含量有一定的關(guān)系。由上述結(jié)果可知，香氣成分在兩類柑橘汁中分布具有特征性，可利用主成分分析對(duì)兩類柑橘汁進(jìn)行識(shí)別區(qū)分，且對(duì)甜橙汁風(fēng)味有貢獻(xiàn)的主要是酯類和醇類化合物。

圖2 甜橙汁和寬皮柑橘汁的三維主成分分值圖Fig.2 3D-Score plotting of principal components analysis in sweet orange juice and mandarin juice

圖3 甜橙汁和寬皮柑橘汁的主成分分值圖Fig.3 Score plotting of principal components analysis in sweet orange juice and mandarin juice 注：圖中不同種類的香氣物質(zhì)采用不同的形狀和 顏色標(biāo)注，中文名與之對(duì)應(yīng)

3 結(jié)論

采用GC-MS對(duì)8種甜橙汁和8種寬皮柑橘汁進(jìn)行測(cè)定，共檢測(cè)出77種香氣成分，41種為特征香氣(OAV>1)，甜橙汁和寬皮柑橘汁樣品中特有的香氣物質(zhì)分別為14種和7種，且含量最高的香氣物質(zhì)均為萜類；其中甜橙汁中酯類和醇類化合物的種類和含量遠(yuǎn)高于寬皮柑橘汁。此外，兩類柑橘汁樣品在主成分分值圖空間分布上具有特征性，可被主成分分析進(jìn)行區(qū)分和識(shí)別。

綜上，本研究通過GC-MS結(jié)合多元分析法比較了甜橙汁和寬皮柑橘汁的香氣成分種類、含量和特征香氣的差異。在成傳香等[5]基礎(chǔ)上增加了適宜榨汁的柑橘品系的數(shù)量，并進(jìn)一步深入研究了甜橙汁和寬皮柑橘汁香氣物質(zhì)的特征及其醇類和脂類物質(zhì)的具體差異，相比已有研究結(jié)果更加細(xì)化和深入。基于此，后續(xù)研究可以進(jìn)一步通過GC-MS-O對(duì)甜橙汁和寬皮柑橘汁中存在較大差異的酯類和醇類化合物進(jìn)行測(cè)定和感官分析，然后進(jìn)行主體香氣的重組及缺失實(shí)驗(yàn)，探究影響甜橙汁和寬皮柑橘汁香味差異的具體物質(zhì)及其含量關(guān)系。