賴氨酸-半乳糖對TMAO-Fe（II）體系中TMAO熱分解的影響

李穎暢，李雙燕，曹娜娜，劉雪飛，蔡友瓊

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090）

魷魚具有很高的營養價值，含有豐富的氨基酸、還原糖等，屬于低脂肪高蛋白水產品，魷魚體內含有大量的氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO），TMAO具有保持魚體內氮的平衡及調節體內滲透壓的作用[1]。同時TMAO是水產品鮮味的主要成分[2]。魷魚在加熱過程中TMAO熱分解產生甲醛（formaldehyde，FA）、二甲胺（dimethylamine，DMA）和三甲胺（trimethylamine，TMA）[3-4]，魷魚中高含量FA給魷魚產品品質和食用安全帶來了負面的影響[1]，同時對魷魚制品的出口也造成很大的經濟損失。因此，魷魚在加工和運輸過程中的FA超標問題越來越受到人們的重視[5]。

美拉德反應是一種普遍的非酶褐變現象，被廣泛應用于食品加工、煙草加香等多個領域[6-7]。魷魚在加工和貯藏過程發生的褐變反應主要由美拉德反應引起[8]。魷魚體內含有高含量的蛋白質和水解氨基酸，再加上魷魚本身含有的半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖，以及調味料中乳糖、蔗糖等水解產生的還原糖為美拉德反應提供了必須的反應物[9]。魷魚在加工過程中，特別是蒸煮、烘烤的環境中，美拉德反應難免發生。目前國內外對魷魚制品中美拉德反應與TMAO分解的研究較少，Vaisey[10]報道了半胱氨酸（Cys）和Fe2+或Cys和血紅蛋白能催化TMAO分解產生TMA、少量DMA和FA。李豐[11]研究發現乳糖促進TMAO熱分解形成FA，認為魷魚絲貯藏過程中FA的產生與美拉德反應有關。同時，李薇霞[12]研究奶糖中FA產生機理時，認為FA的產生與美拉德反應密不可分；因為魷魚在加工過程中存在美拉德反應，推測FA產生可能與氨基酸和還原糖有關[13]。目前大多數研究均通過外源添加氨基酸或者還原糖探究對魷魚中TMAO熱分解的影響，但關于美拉德反應對TMAO分解反應的影響及機制研究卻鮮見報道。

本實驗在進行體外模擬實驗之前對魷魚中氨基酸和還原糖的成分進行檢測，結果發現魷魚所含的氨基酸中賴氨酸（Lys）、谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量較多；還原糖中Gal含量最多。又因為Lys最易與還原糖發生美拉德反應，因此以TMAO-Fe（II）模擬體系為研究對象，將Lys、Gal以及Lys-Gal的混合溶液分別加入到模擬體系當中進行反應，研究在不同的濃度比、反應時間、反應溫度下對模擬體系中TMAO降解的變化規律。并采用DSC技術探討Lys、Gal、Lys-Gal對TMAO降解的作用機制，為下一步研究蒸煮和煎烤魷魚中TMAO的熱分解機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TMAO標準品（純度＞99%） 國家環境保護總局標準樣品研究所；D-Gal、L-Lys（純度＞98%）生工生物工程（上海）股份有限公司；甲醇（色譜純） 北京DIKMA公司；無水硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對甲苯磺酰氯 天津致遠化學試劑有限公司；甲苯 上海易恩化學技術有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鉀、鐵氰化鉀、氯化鐵 上海國藥集團化學試劑有限公司；以上無特殊說明均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2550紫外-可見分光光度儀 日本島津儀器有限公司；冷凍高速離心機 美國Thermo公司； GC7890氣相色譜儀、液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；DSCQ2000差示熱量掃描儀 美國TA公司；Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司；電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；雷磁PHS-C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

TMAO-Fe（II）體系的制備：20 mmol/L TMAO+0.2 mmol/L Fe（II）+20 mmol/L Tris-乙酸（pH 7）。

試劑配制：用蒸餾水將Lys、Gal配成0.1 mol/L的母液備用。

1.3.1 還原力和褐變程度的測定

取一定量的Lys和Gal的母液將兩者混合定容至100 mL，使溶液中Lys和Gal濃度均為0.08 mol/L。再分別取一定量的Lys、Gal母液各加入蒸餾水定容到100 mL，使濃度為0.08 mol/L。取配好的各溶液10 mL于25 mL具塞試管中，在100 ℃水浴鍋中反應90 min后，冷卻備用，進行還原力和褐變程度的測定。

還原力的測定參考Yen等[14]建立的方法。

褐變程度測定參考Ajandouz等[15]的方法。將反應后的溶液稀釋100 倍，分別在294 nm和420 nm波長處測吸光度，用吸光度表示褐變程度。

1.3.2 溫度對模擬體系中TMAO熱分解的影響

分別取2 mL Lys溶液、Gal溶液、Lys-Gal溶液與2 mL TMAO-Fe（II）溶液（濃度比為4∶1）組成反應體系，分別于60、70、80、90、100 ℃條件下反應30 min后，迅速冷卻，加入1 mL 7.5%的三氯乙酸終止反應，5 000 r/min離心15 min，測定TMAO、FA、DMA、TMA含量。

1.3.3 時間對模擬體系中TMAO熱分解的影響

分別取2 mL Lys溶液、Gal溶液、Lys-Gal溶液與2 mL TMAO-Fe（II）溶液（濃度比為4∶1）組成反應體系，于100 ℃反應條件下分別反應0、15、30、45、60、75 min后，迅速冷卻，加入1 mL 7.5%的三氯乙酸終止反應，5 000 r/min離心15 min后，測定TMAO、FA、DMA、TMA含量。

1.3.4 反應物量比對模擬體系中TMAO熱分解的影響

分別取2 mL Lys溶液、Gal溶液、Lys-Gal溶液與2 mL TMAO-Fe（II）溶液組成反應體系，使溶液中的Lys、Gal、Lys-Gal與TMAO-Fe（II）的濃度比分別為1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1于100 ℃條件下反應30 min后，迅速冷卻，加入1 mL 7.5%的三氯乙酸終止反應，5 000 r/min離心15 min后，測定TMAO、FA、DMA、TMA含量。

1.3.5 體系中TMAO、TMA、FA、DMA的測定方法

TMA測定參考朱軍莉等[16]的方法。TMAO含量測定：先將TMAO還原為TMA后進行測定，取2 mL的反應液加入1%的三氯化鈦溶液0.25 mL，80 ℃水浴90 s，冷卻后同TMA測定方法。

DMA測定參考賈佳[17]的方法。FA測定參考Li Jianrong等[18]建立的高效液相色譜法測定水產品中FA含量。1.3.6 DSC分析用專用坩堝稱取5～10 mg的樣品。測試條件：溫度20～200 ℃，氮氣氣氛，以15 ℃/min條件進行升溫。

1.4 數據分析

每個實驗重復3 次，采用Origin 9.1軟件作圖，SPSS 19.0對數據進行方差分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 Lys、Gal、Lys-Gal的還原力和褐變程度

表1 Lys、Gal、Lys-Gal的還原力和褐變程度Table 1 Reducing powers and browning degrees of Lys, Gal and Lys-Gal

吳帥帥等[19]研究發現DMA、FA的生成與美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）的抗氧化性有相關性。此外有研究表明一些具有還原性的物質使TMAO發生非酶降解[10]，且TMAO非酶途徑與水產品的貯藏溫度和還原條件有關。因此研究Lys、Gal、Lys-Gal溶液的褐變程度和還原力，并探究其抗氧化性，為研究Lys、Gal、Lys-Gal對TMAO降解的影響奠定基礎。由表1可以看出，Lys、Gal和Lys-Gal都發生了不同程度的褐變，但是Lys-Gal在高溫條件下反應生成MRPs的紫外吸光度和褐變程度顯著（P＜0.05）增加，高于單獨的Lys和Gal。這是因為隨著Lys-Gal美拉德反應的進行，促進了褐色素物質的生成，從而加深了反應產物的褐變程度[20]。Hwang等[21]報道了MRPs的還原力與紫外吸光度和褐變程度有關。Yilmaz等[22]報道了MRPs水溶液在100 ℃和200 ℃條件下分別加熱10、20、30 min均具有抗氧化活性。還原力是反應物質抗氧化作用的重要指標，通常樣品的還原力與抗氧化能力呈正相關[23]。從表1可以看出，Lys-Gal反應產生的MRPs在還原力方面明顯高于單獨的糖和氨基酸，這是因為在反應過程中MRPs可以提供電子，使Fe3+還原為Fe2+，起到還原作用[24]。

2.2 溫度對模擬體系中TMAO降解的影響

圖1 加熱溫度對各體系中TMAO、FA、DMA和TMA含量變化的影響Fig. 1 Effects of heating temperature on the contents of TMAO, FA,DMA and TMA in each model system

通過上述的實驗結果發現Lys-Gal產生的MRPs產物在還原力和褐變程度方面比Gal、Lys強，因此進一步研究了在60～100 ℃加熱后Lys-Gal、Gal、Lys對TMAO熱分解的變化規律，由圖1可見，隨著反應溫度的升高，對照組和處理組的TMAO含量均降低表現出相似的變化趨勢，逐漸熱分解為FA、DMA、TMA。相對于對照組、Gal-TMAO-Fe（II）和Lys-TMAO-Fe（II）而言，溫度越高Lys-Gal-TMAO-Fe（II）體系中TMAO降解程度越顯著（P＜0.05），相應FA、DMA、TMA的含量也最高，但在90～100 ℃之間Lys-Gal處理組的FA含量有下降的趨勢，分析可能是隨溫度的升高，體系中其他反應產物濃度越來越大，影響了FA的溶解度，因此FA含量有下降的趨勢[25]。但整個過程FA含量仍是增加的，朱軍莉等[26]研究發現加熱可能會使FA揮發，使FA含量略有下降，但是FA含量總體增加。本實驗中Gal、Lys在較高溫度下可以促進TMAO分解，這一結果與陳帥等[27]研究結果一致。同時本實驗也表明了Lys-Gal的混合物在較高的溫度下對TMAO降解的促進作用最強，其次是Gal、Lys。

2.3 時間對模擬體系中TMAO降解的影響

圖2 加熱時間對各體系中TMAO、FA、DMA和TMA含量變化的影響Fig. 2 Effects of heating time on the contents of TMAO, FA, DMA and TMA in each model system

由圖2可知，隨著加熱時間延長，對照組和3 個處理組的TMAO熱分解程度增加，其中Lys-Gal-TMAO-Fe（II）中的TMAO含量減少最顯著（P＜0.05），從最初的2 644.4 mg/L下降至800.83 mg/L，降解率為69.71%，分別是對照組、Gal-TMAO-Fe（II）、Lys-TMAO-Fe（II）組的1.7、1.3 倍和1.4 倍，相應的分解產物FA、DMA、TMA也明顯高于另外3 組。這是因為隨著反應時間的延長，Lys-Gal反應生成MRPs的抗氧化性更高[28]，還原力更大，促進了TMAO非酶途徑的降解[19]。從而使TMAO降解率更大，FA、DMA、TMA生成量最多。

2.4 反應物量比對模擬體系中TMAO降解的影響

圖3 反應物量比對各體系中TMAO、FA、DMA和TMA含量變化的影響Fig. 3 Effects of reactant ratio on changes in TMAO, FA, DMA and TMA contents in each model system

由圖3可知，加入Gal、Lys、Lys-Gal后TMAO含量下降，FA、DMA、TMA含量有所升高均高于對照組，說明Gal、Lys、Lys-Gal能促進TMAO的降解，隨著Gal、Lys、Lys-Gal濃度的增大，TMAO降解速度和FA、DMA、TMA的生成速度逐漸增快，Lys-Gal-TMAOFe（II）中的各指標變化大于Lys-TMAO-Fe（II）和Gal-TMAO-Fe（II）兩組，并且各指標隨著濃度的增加呈顯著變化（P＜0.05）。當Lys-Gal與TMAO的比值為4∶1時TMAO質量濃度降為1 217.81 mg/L，相應的分解產物FA、DMA、TMA的生成量最多。這是因為隨著反應濃度的增加，Lys-Gal生成的MRPs可以阻止Fe2+被氧化從而促進TMAO分解，使FA、DMA、TMA生成量高于其他組。

2.5 Lys、Gal、Lys-Gal對模擬體系中TMAO熱分解的影響

通過分析DSC曲線形狀的變化可反映樣品的穩定性[29]。圖4A顯示了隨著溫度的升高，TMAO標準品逐漸出現了均勻失重的現象，可以看出從55 ℃開始TMAO標準品的DSC曲線圖向下呈吸熱狀態，在98.75 ℃時出現最小值，這是因為TMAO為標準品純度為98%，其所含雜質揮發所致；整個過程無明顯的吸熱和放熱峰，表明TMAO標準品在整個揮發過程中只需要吸收熱量。這一結果與朱軍莉等[30]研究的TMAO熱分解結果一致。

圖4 TMAO（A）、TMAO-Fe（II）（B）、Lys-TMAO-Fe（II）（C）、Gal-TMAO-Fe（II）（D）、Lys-Gal-TMAO-Fe(II)（E）熱分解的DSC圖Fig. 4 DSC curves for thermal decomposition of TMAO (A), TMAOFe (II) (B), Lys-TMAO-Fe (II) (C), Gal-TMAO-Fe (II) (D), and Lys-Gal-TMAO-Fe (II) (E)

圖4 B顯示了TMAO-Fe（II）的熱分解情況，可以明顯看出DSC曲線產生了吸熱和放熱峰，在93.41 ℃時出現第一階段的吸熱峰，可能是樣品從固體向熔融狀態轉變的過渡態[31]，此時TMAO開始熔化發生固態相變；第2階段的吸熱峰出現在162.28 ℃，此階段TMAO開始分解。說明加入Fe2+后促進了TMAO高溫分解，使主要的分解反應在較低的溫度下發生。可以看出在126.18 ℃出現了放熱峰，可能是由于Fe2+在高溫的條件下容易被氧化為Fe3+所致[30]。

圖4C、D分別顯示了Gal-TMAO-Fe（II）、Lys-TMAO-Fe（II）的分解過程，Gal-TMAO-Fe（II）中吸熱階段分別在68.35 ℃和137.04 ℃的時候出現吸熱峰，在100.03 ℃出現放熱峰；Lys-TMAO-Fe（II）中的2 個吸熱階段在83.6 ℃和130.95 ℃時出現吸熱峰，在111.01 ℃出現放熱峰，與TMAO-Fe（II）體系的DSC曲線圖相比，加入Gal、Lys后吸熱和放熱峰的位置都出現了前移，TMAO熔融和分解溫度提前，又因為整個實驗過程的處理條件相同，所以Gal、Lys對TMAO降解的促進作用大于Fe2+，更容易使TMAO進行分解。

圖4E顯示了Lys-Gal-TMAO-Fe（II）的DSC曲線圖，出現了3 個吸熱峰，第1階段吸熱峰溫度為65.28 ℃，與之前4 個樣品的DSC圖相比較，TMAO分解溫度明顯變低，并且Lys-Gal使TMAO分解階段由2 個吸熱階段變為了3 個吸熱階段，分析可能的原因是因為Lys-Gal的還原力較高，使TMAO的分解反應在更低的溫度下進行，從而加速了TMAO的分解。從整個DSC圖可以看出Lys-Gal相較于單個的糖和氨基酸更能降低TMAO的分解溫度。

3 結 論

相對Lys和Gal，Lys-Gal混合物反應形成的MRPs表現出更高程度的褐變和更好的還原能力，其抗氧化能力更強。

Gla、Lys、Lys-Gal這3 種添加物均可以促進TMAO降解生成FA、DMA和TMA，相同條件下Lys-Gal-TMAO-Fe（II）體系反應程度更高一些，TMAO降解程度更大，這可能是因為Lys-Gal在高溫條件下生成MRPs的還原性較強，從而更容易促進TMAO降解。

從DSC圖可以看出Lys、Gal、Lys-Gal可以使TMAOFe（II）體系熱反應的熱分解溫度明顯降低，表明3 種物質參與并加快了TMAO-Fe（II）的熱分解反應，使TMAO-Fe（II）中TMAO分解需要較少的能量，加速TMAO的熱分解，產生更多的FA、DMA和TMA。