代謝工程優化大腸桿菌高效合成L-苯丙氨酸

門佳軒，熊 博，郝亞男，李 旋，劉益寧，謝希賢

（天津科技大學生物工程學院，代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津 300457）

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，L-Phe）是一種重要的藥品和食品化學品的中間體，參與合成動物體內重要的神經遞質與激素，在醫藥、食品領域均有廣泛應用[1]。作為一種抗癌藥物的載體，L-Phe可將抗癌藥物導入腫瘤位置，在抑制腫瘤增長的同時又可大幅降低藥物毒副作用。此外，L-Phe也是低熱量甜味劑阿斯巴甜的主要合成原料。近年來，隨著腫瘤藥物及甜味劑阿斯巴甜的市場需求不斷增加，L-Phe供應也在逐年增長[2]，這對L-Phe的工業生產提出了更高的要求。此前，L-Phe生產方法主要分為化學合成法、酶法以及微生物發酵法。近年來，由于化學合成法及酶法生產成本高昂、材料來源有限及環境污染嚴重等問題，L-Phe主要生產方法已發展為相對經濟環保的微生物發酵法[3]。微生物發酵法中產能主要取決于工程菌株的性能，高效的工程菌株可有效提高綜合產能并節約生產成本。然而，現有工程菌株普遍存在生產效率低下以及攜帶質粒等問題，導致生產成本較高，限制了規模化工業應用。因此，構建1 株高效、無質粒的L-Phe工程菌株意義重大。

隨著合成生物學及系統代謝工程等技術手段的發展，L-Phe的生物合成及代謝調控在大腸桿菌中得到廣泛研究。L-Phe合成途徑由中心代謝途徑、莽草酸途徑及分支途徑3 部分組成，常規L-Phe生產菌株構建策略也主要集中在這3 個方面[4]。首先是解除雙功能酶PheA和3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate，DAHP）合成酶AroG的反饋抑制并增強其表達。Backman等[5]在1 株酪氨酸缺陷菌株中通過質粒過表達了解除反饋抑制的pheAfbr（抗反饋抑制）和aroFfbr基因，發酵36 h后，產量達50 g/L。其次是增強前體物赤蘚糖-4-磷酸（erythrose-4-phosphate，E4P）與磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）的供應。由于PEP分流十分明顯，大部分參與到磷酸葡萄糖轉移酶（glucose phosphotransferase，PTS）系統的攝糖作用中[6]，因此多數研究都是利用其他酶代替PTS系統進行糖的攝取[7-8]。而這種策略在節省大量PEP的同時會嚴重影響菌體生長，因此不適于工程菌株的構建。最后則是強化莽草酸途徑部分基因。Liu Yongfei等[9]在1 株L-酪氨酸缺陷型大腸桿菌中通過質粒過表達了去反饋抑制的關鍵酶及3-脫氫奎寧酸脫水酶基因aroD，同時過表達大腸桿菌自身的半乳糖透性酶基因galP及葡萄糖激酶基因glk以代替失活的PTS系統，利用該菌株發酵52 h后，L-Phe產量達72.9 g/L，生產強度達到1.4 g/（L·h），是目前為止報道的L-Phe最高產量。

上述菌株的改造策略雖指導了后續L-Phe菌株的構建，但與現有工程菌株一樣，由于上述菌株為缺陷型菌株且攜帶質粒等問題，發酵過程中需要添加抗生素和缺陷型氨基酸以保證菌株穩定生產，這些弊端無疑會增加工業生產的成本，降低產品在市場上的競爭力。此外，常規改造策略多是對雙功能酶PheA、DAHP合成酶、前體物供應等關鍵節點進行改造，少有全面系統對大腸桿菌中L-Phe代謝網絡進行優化，這就可能導致代謝流至某一步反應時發生阻塞，積累毒副產物，影響菌體生產。針對上述問題，本研究從大腸桿菌基因組水平出發，通過代謝工程技術手段，分模塊依次對L-Phe分支途徑、莽草酸途徑以及中心代謝通路進行系統全面的優化。首先，通過強化L-Phe合成支路獲得1 株能夠初步積累L-Phe的菌株；在此基礎上，對莽草酸途徑各基因的表達強度進行優化以確定最適表達量；最后，通過增強中心代謝途徑中前體物的供應，獲得1 株穩定高產、無質粒的非缺陷型大腸桿菌L-Phe生產菌株（圖1）。

圖1 大腸桿菌L-Phe合成代謝路徑Fig. 1 Biosynthetic pathways of L-phenylalanine in Escherichia coli

1 材料與方法

1.1 培養基

LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。

2×YT培養基：蛋白胨1.6 g/100 mL，酵母粉1 g/100 mL，NaCl 0.5 g/100 mL。

斜面培養基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖5 g/L，瓊脂20 g/L。

種子培養基：酵母粉10 g/L，(NH4)2SO44 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，NaCl 1 g/L，微量元素混合液1 mL/L，FeSO4·7H2O 5 mg/L，CaCl2·2H2O 0.015 g/L。

發酵培養基：酵母粉5 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，檸檬酸鈉2 g/L，NaCl 1 g/L，微量元素混合液1.5 mL/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，CaCl2·2H2O 0.015 g/L。

微量元素混合液：Na2MoO4·2H2O 2.5 g/L，AlCl3·6H2O 2.5 g/L，NiSO4·6H2O 2.5 g/L，CoCl2·6H2O 1.75 g/L，CaCl2·2 H2O 10 g/L，ZnSO4·7 H2O 0.5 g/L，CuCl2·2 H2O 0.25 g/L，H3BO30.125 g/L。

1.2 儀器與設備

5 L自動控制發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；UV 200II紫外-可見波長檢測器 美國Laballiance設備公司；1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；SBA-40C生物傳感儀 山東省科學院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 工程菌株的構建

利用規律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技術對菌株基因進行改造，完成工程菌的構建[10]。CRISPR/Cas9系統包括pGRB和pREDCas9兩個質粒。pREDCas9質粒主要由RED重組酶、Cas9蛋白及pGRB質粒消除系統組成，含奇霉素抗性（質量濃度100 mg/L、32 ℃培養）。pGRB質粒主要由啟動子、gRNA-Cas9蛋白結合區域和終止子組成，含氨芐青霉素抗性（質量濃度100 mg/L、37 ℃培養）。pGRB質粒能夠轉錄出相應的gRNA與Cas9蛋白形成復合物并識別到靶位點，實現靶位點基因雙鏈斷裂[11]。同時，目的DNA片段在重組酶作用下與斷裂雙鏈發生同源重組從而被整合在基因組上，完成基因編輯。

1.3.1.1 gRNA質粒構建與目的DNA片段的獲得

設計兩條反向互補的單鏈DNA，退火后形成雙鏈DNA，該雙鏈兩端由pGRB的同源序列組成，中間部分為靶位點的特定gRNA序列。雙鏈DNA與線性化pGRB在同源重組酶作用下形成gRNA表達質粒。

使用Primer 5.0設計引物，以待編輯基因上下游序列為模板，設計上下游同源臂的引物；以待整合基因為模板，設計整合基因的擴增引物。通過聚合成酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）方法擴增待編輯基因的上下游同源臂和整合基因片段，后經重疊PCR制備重組片段。

1.3.1.2 重組菌株構建

將pREDCas9質粒電轉導入大腸桿菌W3110感受態細胞中，經菌落PCR篩選出陽性轉化子，并接種至LB培養基，32 ℃培養10～12 h后，接1～1.5 mL菌液轉至100 mL 2×YT培養基中，32 ℃培養，當細菌OD600nm達0.1～0.2時，添加0.1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷溶液誘導重組酶表達，繼續培養至OD600nm達到0.4～0.6左右收集菌體，制備電轉感受態。將gRNA質粒和重組DNA片段加入電轉感受態細胞中進行電轉化，于1 mL復蘇液中32 ℃復蘇2 h。然后取100 μL菌液涂布至含奇霉素和氨芐青霉素抗性的LB平板，挑選單菌落進行菌落PCR驗證，將篩選得到的正確陽性重組菌接至含0.2%阿拉伯糖和奇霉素抗性的LB培養基，誘導pREDCas9中的質粒消除系統切割pGRB質粒，最后將僅含pREDCas9質粒的菌株于42 ℃培養10～12 h，消除溫敏性質粒pREDCas9，獲得無質粒菌株。

1.3.2 L-Phe發酵

1.3.2.1 搖瓶發酵

將菌株接種至18 mm×180 mm的試管斜面培養基中，于37 ℃培養2 代，每代12 h，后將二代斜面中的菌株接種至裝有30 mL種子培養基的500 mL圓底瓶中，37 ℃、200 r/min培養8～10 h。然后按10%～15%接種量轉接至裝有30 mL發酵培養基的500 mL擋板瓶中，37 ℃、200 r/min培養24 h。發酵培養基中添加終質量濃度為8 mg/L的苯酚紅作為酸堿指示劑，培養過程中需根據培養基顏色變化手動補加氨水以維持培養基pH 7.0左右，當葡萄糖耗盡時，培養基顏色呈紅色且不變色，通過移液槍一次性補加1 mL的60 g/100 mL葡萄糖溶液維持發酵進行。

1.3.2.2 發酵罐分批補料發酵

菌株活化后，用無菌水將茄形瓶中的菌落沖洗下來制成菌懸液，全部接種到裝有3 L種子培養基的5 L發酵罐中進行菌體擴大培養，發酵過程中控制pH 7.0左右，溫度恒定在37 ℃，溶氧保持在25%～35%之間，至種子OD600nm達到10～16時，按15%的接種量接入裝有3 L發酵培養基的5 L發酵罐中進行發酵培養，發酵過程中維持pH 7.0左右，溫度保持在37 ℃，溶氧控制在25%～35%之間。當罐中的葡萄糖耗盡時，開始以一定速率流加質量濃度80 g/100 mL的葡萄糖溶液，維持罐中葡萄糖質量濃度在0.1～5 g/L內。

1.3.2.3 發酵過程中檢測與分析

發酵過程中菌體生物量通過紫外分光光度儀檢測OD600nm。發酵液葡萄糖質量濃度通過SBA生物傳感儀檢測。發酵液L-Phe含量通過高效液相色譜儀檢測，色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse AAA（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為10%乙腈溶液，柱溫40 ℃，檢測波長210 nm，流動相總流速1 mL/min，采用二元梯度洗脫的方法。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 L-Phe合成支路強化

按系統代謝工程思路對L-Phe合成途徑進行模塊化改造，首先對合成途徑的后半段進行改造，即L-Phe合成途徑中分支酸到L-Phe的反應。這一過程由分支酸變位酶/預苯酸脫水酶PheA和轉氨酶TyrB共同參與完成，是L-Phe合成途徑中的主要限速步驟之一。其中PheA受到L-Phe強烈的反饋抑制。此外，與L-Phe合成和轉運相關酶的表達還受到抑制因子TyrR的抑制[12-13]。根據報道，可通過保留PheA酶的分支酸變位酶區（1～109位氨基酸）和預苯酸脫水酶區（110～285位氨基酸）解除L-Phe的反饋抑制[14-15]。

圖2 過表達雙功能酶PheA及轉氨酶TyrB對L-Phe產量的影響Fig. 2 Effect of overexpression of bifunctional enzyme PheA and transaminase TyrB on L-Phe production

對此，首先以本實驗室的大腸桿菌W3110為出發菌株，通過敲除該菌株乳糖操縱子中的lacI基因，獲得菌株PHE1，以解除LacI阻遏蛋白對啟動子Ptrc的阻遏調控作用。在此基礎上，構建解除反饋抑制的pheA*片段，然后在tyrR位點將pheA*與tyrB串聯成操縱子，由強啟動子Ptrc啟動轉錄，構建菌株PHE2。搖瓶發酵測試后，檢測到L-Phe有積累。為驗證其最適表達量，又在假基因gapC及yeeP位點分別整合了這2 種酶的雙拷貝及三拷貝，均由Ptrc啟動轉錄，分別構建了PHE3-1和PHE3-2。搖瓶結果如圖2所示，PHE2的L-Phe產量為6.5 g/L，PHE3-1的L-Phe產量達8.8 g/L，較PHE2提高了36.22%。而PHE3-2的產量又下降至6.5 g/L，說明關鍵酶的表達不宜過強，由Ptrc啟動子控制的關鍵酶PheA及TyrB雙拷貝效果最好。

2.2 莽草酸合成途徑優化

表1 莽草酸途徑基因的改造對L-Phe生產的影響Table 1 Effects of modification of genes in the shikimate pathway on L-Phe production

莽草酸途徑連接中心代謝途徑和分支酸途徑，是L-Phe合成途徑的重要組成部分[16]。作為連接中心代謝途徑與分支途徑的中間通路，莽草酸途徑的通暢對于平衡代謝通量分布，減少毒副產物（如莽草酸等）積累至關重要[17-18]。本研究通過對莽草酸途徑中各反應酶的表達強度進行梯度優化，測試莽草酸途徑中各基因的改造對L-Phe合成及菌體生長的影響。在PHE3-1的基礎上，依次替換莽草酸途徑各酶的啟動子，從莽草酸途徑后段向前逐步確定各酶最適活力，構建了表1菌株。搖瓶發酵結果如表1所示，其中PHE5-2（過表達5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶AroA）產量為9.3 g/L，較PHE3-1（8.4 g/L）提高了10.56%；在此基礎上，依次對其余酶的表達量進行了優化，最終僅有PHE8-2（過表達3-脫氫奎寧脫水酶AroD）對產物合成產生了正向作用。PHE8-2的L-Phe產量達11.9 g/L，與PHE5-2相比提高了27.96%。推測改造后的正向菌株應對產量或生長有積極的影響。經過多輪優化篩選，最終確定在6 種酶中，僅有5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶AroA和3-脫氫奎寧脫水酶AroD可以通過適度強化提高L-Phe產量且不影響菌體生長，其余酶的表達水平已達最佳，無需優化。

莽草酸途徑中，PEP和E4P在DAHP合成酶作用下縮合生成DAHP是L-Phe合成途徑的另一限速步驟[19]。DAHP合成酶由3 種同工酶AroF、AroG、AroH組成，其中AroG占大部分酶活力，受到L-Phe的反饋抑制[20-21]。根據文獻報道，將編碼AroG蛋白的第180位絲氨酸突變為L-Phe可解除L-Phe的反饋抑制作用[22-23]。本研究以PHE8-2為出發菌，分別整合了由強啟動子Ptrc控制的aroG*基因及其雙拷貝，構建了菌株PHE10及PHE11。搖瓶發酵結果如圖3所示，PHE10與PHE11的L-Phe產量分別為16.8 g/L與16.6 g/L，其中PHE10較PHE8-2（11.23 g/L）提高了49.77%，說明適度強化DAHP合成酶可顯著提高L-Phe產量。

圖3 增強DAHP合成酶表達對L-Phe合成的影響Fig. 3 Effects of enhanced expression of DAHP synthase on L-Phe synthesis

2.3 前體物供應增加

PEP作為合成芳香族氨基酸的前體物之一，同時還被多條代謝途徑競爭，分流十分明顯，僅有少部分PEP能夠流向莽草酸途徑，因此PEP的供應也是合成L-Phe的限制性因素之一[14]。中心代謝途徑中一部分PEP會在丙酮酸激酶的作用下生成丙酮酸，隨后進入三羧酸循環[24]。因此，為在增加PEP供應的同時減少對菌體生長的影響，僅敲除丙酮酸激酶（pykF與pykA編碼）中的pykF基因，構建了菌株PHE12。搖瓶發酵結果如圖4所示，PHE12產量達到20.5 g/L，比出發菌PHE10（16.94 g/L）提高了21.13%。說明敲除丙酮酸激酶可有效增加PEP供應，進而提升L-Phe產量。

圖4 敲除丙酮酸激酶pykF對L-Phe合成的影響Fig. 4 Effect of pykF knockout on L-Phe synthesis

此外，中心代謝途徑中丙酮酸也會在磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps的作用下反向生成PEP[25]。因此，本研究嘗試在PHE12基礎上用不同強度的啟動子對pps基因進行強化，分別構建PHE13-1、PHE13-2和PHE13-3（分別由PBBa_j23106、Ptrp和Ptrc進行調控）。搖瓶發酵結果如圖5所示，與ΔpykF不同，增強pps基因表達后，L-Phe產量呈不同程度的降低，而生長并未受到明顯影響。由于PykF在丙酮酸激酶中占主要酶活力，在ΔpykF后，PEP生成丙酮酸的代謝流被減弱，胞內丙酮酸含量減少。而相應地，為保證生長不受影響，菌體通過自身調節機制強化了PEP到草酰乙酸的合成[26]。此時過表達磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps也再難產生更多PEP，限制了L-Phe產量。此外，胞內E4P供應不足時，也無法與PEP縮合生成DAHP，使反應向下進行。為了驗證本研究推測，隨后對轉酮酶TktA進行了強化。

圖5 增強磷酸烯醇丙酮酸合成酶表達對L-Phe合成的影響Fig. 5 Effects of enhanced expression of phosphoenolpyruvate synthase on L-Phe synthesis

與PEP不同，E4P在代謝網絡中分流并不明顯，可通過過表達轉酮酶基因tktA增加E4P的供應[27-28]。為驗證上述猜想，在PHE13-3的基礎上嘗試利用不同強度啟動子控制轉酮酶基因tktA，分別構建了PHE14-1和PHE14-2（分別由PtktA和PBBa_j23106進行調控）。搖瓶發酵結果如圖6所示，增強E4P供應后，產量仍呈下降趨勢，可以判斷此前的E4P供應充足，不需要加強，且在ΔpykF后，通過強化磷酸烯醇丙酮酸合成酶Pps再難增加PEP供應。此外，在本課題組之前研究中，也嘗試過敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶Ppc，以及利用其他酶代替PTS系統進行糖的攝取以增加PEP供應，而這些策略在增加PEP的同時會嚴重影響菌體的生長。因此僅保留ΔpykF菌株（PHE12）作為最終改造的無質粒、非缺陷型L-Phe工程菌株，并進行5 L發酵罐發酵測試。

圖6 增強轉酮酶TktA的表達對L-Phe合成的影響Fig. 6 Effect of enhanced expression of transketolase TktA on L-Phe synthesis

2.4 工程菌發酵罐發酵測試結果

為測試效果最佳的PHE12的綜合生產性能，進行5 L發酵罐分批補料發酵培養（發酵過程無需添加抗生素及缺陷型氨基酸，降低了發酵生產成本）。如圖7所示，發酵初期菌體生長迅速，于36 h OD600nm值達到最高，隨后逐漸降低。發酵12 h后，L-Phe產量呈穩定趨勢一直增長。生產至48 h后，L-Phe產量達81.8 g/L，生產強度達1.7 g/（L·h），糖酸轉化率（以葡萄糖計）為0.24 g/g。

圖7 工程菌PHE12在5 L發酵罐分批補料發酵曲線Fig. 7 Time course of fed-batch fermentation of the engineered strain PHE12 in a 5 L bioreactor

3 結 論

本研究按照系統代謝工程思路對L-Phe代謝途徑進行模塊化改造，構建了1 株非缺陷型、無質粒、高效合成L-Phe的大腸桿菌工程菌株。該菌株構建過程如下：1）通過在轉錄抑制因子TyrR位點處整合解除反饋抑制的雙功能酶與轉氨酶，增強了L-Phe的合成；2）通過對莽草酸途徑各基因進行梯度強度優化，確定了各反應中酶的最適表達強度，同時確保了后半段代謝通路的通暢；3）通過引入解除反饋抑制的DAHP合成酶增強L-Phe的合成途徑；4）通過敲除丙酮酸激酶PykF增加PEP的供應，進而增加L-Phe產量，以葡萄糖為碳源進行分批補料發酵48 h，工程菌PHE12的L-Phe產量達到81.8 g/L，糖酸轉化率達0.24 g/g，生產強度達1.7 g/（L·h）。目前文獻報道的L-Phe最高發酵水平為72.9 g/L，生產強度為1.4 g/（L·h）（發酵52 h），與該菌株相比，PHE-12的L-Phe產量提高了12.2%，生產強度較該菌株提高21.4%。與現有L-Phe工程菌株相比，該工程菌具備以下優點：1）菌株為非缺陷型且不含質粒，避免了抗生素及缺陷型氨基酸的使用；2）生產強度高。該工程菌的構建降低了生產成本，具有良好的工業化前景。