抗耐藥性大腸桿菌乳酸菌的篩選及抑菌機制

孫 悅，劉佳伊，陳 璐，杜 宏，白鳳翎,*，呂欣然,*，張德福，郭曉華，勵建榮

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，大連工業大學和渤海大學海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 錦州 121013；2.山東美佳集團有限公司，山東 日照 276800）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli），俗稱大腸桿菌，是雞肉及雞肉制品中的重要致病菌[1-3]，目前，由于我國雞禽業從傳統的散養方式轉變為高密度養殖方式，增大了雞群體的發病率，同時也增加了抗生素在養殖過程中的使用量，但長期使用抗生素會導致細菌產生耐藥性，引起雞禽局部或全身感染，嚴重時可造成全群覆滅，會給雞禽養殖業造成巨大的經濟損失[4-5]。此外，E. coli產生的耐藥性能通過食物鏈快速而廣泛的傳播，使人源、畜源致病性E. coli獲得相同的耐藥基因，使其產生相同的耐藥譜，耐藥性的傳播將衍生為全球公共衛生焦點問題，對人類健康和流行病的防治構成嚴重威脅[6]。研究發現，E. coli易對阿奇霉素、環丙沙星、四環素等藥物產生耐藥性[7]，因此亟需開發出一類安全高效且可以對抗多重耐藥菌的抗菌劑。生物抗菌劑具有安全高效、不易產生耐藥性和無毒副作用等優點，是控制食品中耐藥菌的優良選擇[8]。

乳酸菌作為一種新型生物抗菌劑，目前已在肉制品、乳制品、果蔬、水產品等領域取得良好的應用效果，其主要通過產生有機酸、細菌素等代謝物質抑制細菌的生長繁殖[9-10]。Perales等[11]用乳酸菌細菌素AS-48和Nisin抑制從新鮮的山羊奶酪中提取出4 株耐藥性金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），其最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）均在0.16～0.43 μmol/L之間，當二者協同處理指示菌時，MIC下降至0.04～0.05 μmol/L之間。楊柳[12]應用中藥丹參提取物抑制耐環丙沙星的E. coli，MIC為253 μg/mL，當其與環丙沙星聯用時，M I C 僅為原來的一半。蘭仕梅等[13]用連翹單獨作用于多重耐藥E. coli時，MIC為125 mg/mL，當連翹與四環素聯合作用時，對耐藥性E. coli的MIC為62.5 mg/mL。目前，關于從傳統發酵食品中分離出抗耐藥性E. coli的乳酸菌及其拮抗作用機制研究比較鮮見[14]。

本研究以從河北石家莊養雞場雞糞中分離出的對阿奇霉素、大環內酯類、氯霉素、喹諾酮類耐藥的E. coli為目標菌，采用牛津杯打孔法從遼寧葫蘆島酸菜湯分離篩選對耐藥性E. coli拮抗活性較強的乳酸菌。通過測定乳酸菌粗提物對耐藥性E. coli電導率、胞外蛋白、紫外吸收物質含量，初步探究乳酸菌粗提物對耐藥菌的作用機制。以期為利用生物抗菌劑控制耐藥菌提供一定的理論基礎和應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌株

酸菜購于遼寧葫蘆島市場；耐藥性E. coli0001為河北石家莊養雞場雞糞中分離，保藏于本院微生物學與分子生物學實驗室。

1.1.2 培養基與試劑

LB培養基、MRS培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司；阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、環丙沙星、四環素、亞胺培南、磷霉素、慶大霉素、多黏菌素、頭孢他啶10 種抗生素（質量濃度均為15 μg/mL）上海廣銳生物科技有限公司；瓊脂糖 美國Sigma公司；TaqPCR Master mix、細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、DNA Marker-D 生工生物工程（上海）股份有限公司；乳酸菌生化鑒定管 杭州天合微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DL-CJ-2N型超級潔凈工作臺 東聯哈爾（北京）儀器制造有限公司；DYY-8C電泳儀 北京市六一儀器廠；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、5804R冷凍高速離心機 德國艾本德股份有限公司；Cheimdox XRS凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；S-4800掃描電鏡 日本日立公司；賽福智能生化培養箱寧波海曙賽福實驗儀器廠；UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；PHSJ-3F pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；FA1004精密電子天平 上海恒平科學儀器有限公司；IKA Vortex GENIUS 3振蕩器 德國IKA公司；GI54DS立式高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

參照文獻[15]。無菌條件下取適量酸菜湯樣品，采用無菌接種環挑取樣品汁液1 環，劃線于含1.0% CaCO3的MRS固體培養基，37 ℃條件下培養48 h，選取有溶鈣圈的乳白色典型菌落進行過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色。

1.3.2 乳酸菌粗提物的制備

將-80 ℃保存的乳酸菌菌株以2%的接種量在MRS液體培養基中活化3 代，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，用0.45 μm濾菌器過濾上清液，得無細胞上清液。將乳酸菌上清液和乙酸乙酯按5∶1的比例加入至分液漏斗中，充分振蕩混勻，靜置5 min出現明顯分層現象，取上層乳化液倒入旋轉蒸發瓶中，該萃取步驟重復5 次，并將得到的乳化液統一收集，真空條件下55 ℃、100 r/min旋轉蒸發至液體顏色澄清，統一保存。在真空度0.420、-40 ℃條件下真空冷凍干燥48 h至粉末顆粒狀，后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.3 供試菌菌懸液的制備

將河北石家莊養雞場雞糞中分離的耐藥性E. coli 0001以2%的接種量接種于MRS液體培養基中，傳3 代，30 ℃培養24 h，用生理鹽水稀釋濃度至1.0×106CFU/mL。

1.3.4 乳酸菌菌株鑒定

1.3.4.1 生理生化反應

參照文獻[16-17]對乳酸菌菌株進行生理生化鑒定。

1.3.4.2 菌株的16S rDNA鑒定

參 照 文 獻[ 1 8 ] 。 P C R 擴 增 引 物 ： 2 7 f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-TACGGYTACCTTTGTTACGACTT-3’）。PCR應用25 μL擴增反應體系：上下游引物各1.0 μL，2.0 ng/μL DNA模板1.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，Taq PCR Master mix 12.5 μL，用超純水補足到25 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，循環30 次，4 ℃保溫。

1.3.5 乳酸菌粗提物對耐藥性E. coli抑菌機理分析

1.3.5.1 乳酸菌粗提物對耐藥性E. coli的MIC

參照Rapper等[19]的方法。將凍干后的菌株XCT1-1粗提物分別加至10 mL LB液體培養基中，使其終質量濃度分別為24、12、6、3、1.5、0.75 mg/mL。再分別加入200 μL 1.0×106CFU/mL E. coli菌懸液，30 ℃培養24 h，通過肉眼觀察到無渾濁現象對應的濃度即為乳酸菌的MIC。

1.3.5.2 不同抗菌藥物與乳酸菌粗提物復合對耐藥性E. coli拮抗作用

參照王唯霖[20]的方法。采用牛津杯打孔法，每個孔均加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC），再相應加入阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、環丙沙星、四環素、亞胺培南、磷霉素、慶大霉素、多黏菌素、頭孢他啶10 種具有代表性的藥敏紙片，30 ℃培養24 h。

1.3.5.3 乳酸菌粗提物對耐藥性 E. coli電導率的影響

參照范宇[21]的方法。分別在10 mL E. coli菌懸液中加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）、阿奇霉素、菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）+阿奇霉素，同時以未經處理的E. coli菌懸液為對照組。30 ℃恒溫培養，每隔2 h取樣，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，分別取其上清液測定電導率。

1.3.5.4 乳酸菌粗提物對耐藥性 E. coli胞外蛋白的影響

參考Bradford[22]的方法，分別取1 mL 1.3.5.3節方法所得的上清液，加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，室溫下反應2 min，在595 nm波長處測定其OD值，并按下式計算胞外蛋白含量：

1.3.5.5 乳酸菌粗提物對耐藥性 E. coli紫外吸收物質的影響

按LV Feng等[23]的方法。分別取1 mL 1.3.5.3節方法所得的上清液，260 nm波長處的吸光度即為核酸泄漏含量。

1.3.5.6 乳酸菌粗提物對耐藥性 E. coli細胞結構的影響

參照Bueno等[24]的方法。分別在 E. coli菌懸液中加入菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）、阿奇霉素、菌株XCT1-1粗提物（0.75MIC）+阿奇霉素，同時以 E. coli菌懸液為對照組。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，收集菌體。在2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定過夜，用0.1 mol/L pH 7.2磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，除去殘留戊二醛，分別用50%、80%、100%乙醇進行脫水處理，用膠頭滴管取適量滴于潔凈蓋玻片，自然晾干，噴金鏡檢。

1.4 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 抗耐藥性 E. coli乳酸菌的分離和初篩

從酸菜湯中共分離得到51 株具有白色溶鈣圈的典型菌落，經革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗確定39 株為乳酸菌。采用牛津杯打孔法從39 株乳酸菌中篩選出6 株對耐藥性E. coli具有拮抗活性的乳酸菌，分別為菌株XCT1-1、XCT1-2、XCT1-3、XCT1-4、XCT1-5、XCT1-6，其對耐藥性E. coli的抑菌直徑分別為20.31、15.42、15.69、11.18、14.96 mm。其中，菌株XCT1-1對耐藥性E. coli抑菌直徑最大（圖1），因此，選擇菌株XCT1-1進行下一步研究。

圖1 乳酸菌對耐藥性E. coli拮抗作用Fig. 1 Antagonistic effect of lactic acid bacteria on drug-resistant E. coli

2.2 乳酸菌菌株鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

菌株XCT1-1生理生化鑒定結果見表1，依據文獻[16-17]檢索可初步判斷菌株XCT1-1為乳桿菌屬。

表1 菌株XCT1-1生理生化實驗結果Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain XCT1-1

2.2.2 16S rDNA鑒定

圖2 菌株XCT1-1的16S rDNA基因擴增電泳圖Fig. 2 PCR amplification of 16S rDNA gene of strain XCT1-1

由圖2可知，菌株XCT1-1在1 450 bp處左右出現特異性條帶，表明目標片段被成功擴增。將PCR擴增產物進行測序分析，序列在美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST同源性比對，選取同源性較高的模式菌株，采用MEGA7.0構建系統發育樹，結果見圖3。菌株XCT1-1和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）EU600907.1聚于一支，親緣關系最近，相似度達97%。因此，鑒定菌株XCT1-1被鑒定為植物乳桿菌。

圖3 菌株XCT1-1的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain XCT1-1

2.3 乳酸菌粗提物對耐藥性E. coli抑菌機理分析

2.3.1 乳酸菌粗提物對耐藥性E. coli的MIC

耐藥性E. coli經不同質量濃度植物乳桿菌XCT1-1粗提物處理12 h后，肉眼觀察到6.0 mg/mL及以上質量濃度無渾濁現象，即植物乳桿菌XCT1-1 MIC為6.0 mg/mL。Yi Lanhua等[25]研究發現，從江水中分離出的棒狀乳桿菌（L. coryniformis）XN8產生的細菌素lactocin XN8-A對E. coli和S. aureus的MIC均為6.85 mg/mL，與本實驗的研究結果相似。

2.3.2 不同抗菌藥物與乳酸菌粗提物復合對耐藥性E. coli的拮抗作用

圖4 不同抗菌藥物和植物乳桿菌粗提物復合對耐藥性E. coli的拮抗作用結果Fig. 4 Antagonistic effects of different antibacterial drugs and L. plantarum on drug-resistant E. coli

由圖4可知，阿奇霉素、阿莫西林、氯霉素、環丙沙星、四環素5 種藥物對E. coli均無抑制作用。但加入植物乳桿菌XCT1-1粗提物后，抑菌圈直徑分別達到27.56、27.31、28.91、27.89、28.90 mm，同時也均大于單獨添加植物乳桿菌XCT1-1粗提物的抑菌圈直徑（P＜0.05）。結果表明，植物乳桿菌XCT1-1粗提物對耐藥性E. coli有拮抗活性，同時還能提高了耐藥性E. coli對藥物的敏感性。選擇E. coli耐受的其中一種藥物阿奇霉素進行下一步的研究。

2.3.3 乳酸菌粗提物對耐藥性 E. coli電導率的影響

圖5 植物乳桿菌XCT1-1粗提物對耐藥性E. coli電導率的影響Fig. 5 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on the electrical conductivity of drug-resistant E. coli

細菌菌懸液的電導率變化是細胞膜滲透性變化的間接表現形式[26]。由圖5可知，隨著處理時間的延長，耐藥性E. coli電導率整體呈上升趨勢。經植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的耐藥性E. coli菌懸液電導率值明顯高于未經處理的耐藥性E. coli菌懸液（P＜0.05）。在處理末期第10小時，乳酸菌粗提物最大程度提高了阿奇霉素對耐藥性E. coli的敏感性，且經植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的實驗組與未經處理的耐藥性E. coli菌懸液相比電導率值分別增加了20.54%、21.93%（P＜0.05）；經阿奇霉素處理的實驗組與未經處理的耐藥性E. coli菌懸液相比電導率值無顯著性差異。結果表明：植物乳桿菌XCT1-1粗提物、植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以改變耐藥性E. coli細胞膜的通透性，共同作用效果強可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素對耐藥性E. coli的敏感性。侯媛媛[27]在處理末期第8小時，用大黃酸處理耐藥性E. coli和腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica subsp. enterica）的實驗組比未經處理組電導率值分別高約67.50%、66.67%，與本研究結果相似。

2.3.4 乳酸菌粗提物對耐藥性E. coli胞外蛋白的影響

圖6 植物乳桿菌XCT1-1粗提物對耐藥性E. coli胞外蛋白含量的影響Fig. 6 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on the extracellular protein content of drug-resistant E. coli

蛋白質泄漏是評定細菌細胞膜完整性的一個重要指標[28]。由圖6可知，隨著處理時間的延長，耐藥性E. coli胞外蛋白含量呈現上升趨勢。其中經植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的耐藥性E. coli菌懸液的胞外蛋白含量明顯高于未經處理的耐藥性E. coli菌懸液（P＜0.05）。在處理末期第10小時，乳酸菌粗提物最大程度提高了阿奇霉素對耐藥性E. coli的敏感性，且經植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的實驗組與未經處理的耐藥性E. coli菌懸液相比，胞外蛋白含量分別增加了25.24%、27.93%（P＜0.05）；經阿奇霉素處理的實驗組與未經處理的耐藥性E. coli菌懸液相比，胞外蛋白含量無顯著性差異。結果表明：植物乳桿菌XCT1-1粗提物、植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以破壞耐藥性E. coli細胞壁和細胞膜，共同作用效果強可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素對耐藥性E. coli的敏感性。王維霖[20]在處理末期第8小時，用五倍子提取物處理耐藥性E. coli的實驗組比未經處理組胞外蛋白含量高約75%，與本研究結果相似。

2.3.5 乳酸菌粗提物對耐藥性E. coli紫外吸收物質的影響

圖7 植物乳桿菌XCT1-1粗提物對耐藥性E. coli紫外吸收物質的影響Fig. 7 Effect of the culture supernatant extract of L. plantarum XCT1-1 on UV absorbing compounds of drug-resistant E. coli

核酸的OD260nm值用作評價細胞膜完整性的指標[29]。由圖7可知，經植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的耐藥性E. coli菌懸液核酸泄漏值顯著高于未經處理的耐藥性E. coli菌懸液（P＜0.05）。在處理末期第10小時，乳酸菌粗提物最大程度地提高了阿奇霉素對耐藥性E. coli的敏感性，且經植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）、植物乳桿菌XCT1-1粗提物（0.75MIC）和阿奇霉素共同處理過的實驗組與未經處理的耐藥性E. coli菌懸液相比，核酸泄漏值分別增加了63.56%、77.12%（P＜0.05）；經阿奇霉素處理的實驗組與未經處理的耐藥性E. coli菌懸液相比，核酸泄漏值無顯著性差異。結果表明：植物乳桿菌XCT1-1粗提物、植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用可以破壞耐藥性E. coli細胞壁和細胞膜，共同作用效果強可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素對耐藥性E. coli的敏感性。Alavi等[30]采用松蘿酸處理耐藥性E. coli的實驗組比未經處理組紫外吸收物質含量高約70.59%，與本研究結果相似。

2.3.6 乳酸菌粗提物對耐藥性E. coli細胞結構的影響

圖8 植物乳桿菌XCT1-1粗提物對耐藥性E. coli作用的掃描電鏡結果Fig. 8 SEM photographs showing of the effect of the cultute supernantant extract of L. plantarum XCT1-1 on the cell structure of drug-resistant E. coli

由圖8a可知，未經處理的耐藥性E. coli菌體細胞表面圓潤光滑，結構完整；由圖8b可知，經植物乳桿菌XCT1-1粗提物處理后的耐藥性E. coli菌體細胞邊緣出現褶皺并有溶解跡象；由圖8c可知，經植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用處理后的耐藥性E. coli細胞完整性完全喪失，細胞溶解程度進一步增加，細胞整體結構坍塌。Al-Wrafy等[31]用噬菌體蛋白PAPP使耐藥性銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）細胞膜被破壞，有溶解跡象，噬菌體蛋白PAPP與哌拉西林疊加處理，耐藥性P. aeruginosa細胞結構進一步被破壞，細胞基本溶解。該結果與本研究結果相似。

3 結 論

本研究從遼寧葫蘆島酸菜湯中篩選出1 株對耐藥性E. coli具有較強拮抗活性的植物乳桿菌XCT1-1，抑菌直徑達20.31 mm。經菌株XCT1-1粗提物、菌株XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用耐藥性E. coli后，導致其胞外電導率增加，胞內蛋白合成受到影響，胞內核酸發生泄漏。掃描電鏡結果進一步表明，菌株XCT1-1粗提物、菌株XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同處理耐藥性E. coli后，可破壞E. coli的細胞壁和細胞膜，前者菌體表面出現褶皺，后者菌體表面褶皺嚴重，菌體細胞整體結構坍塌。以上結果表明，植物乳桿菌XCT1-1粗提物、植物乳桿菌XCT1-1粗提物和阿奇霉素共同作用都是通過膜損傷發揮拮抗作用，并推斷共同作用效果強可能是由于乳酸菌粗提物提高了阿奇霉素對耐藥性E. coli的敏感性，且乳酸菌和阿奇霉素可發生協同拮抗效應。研究為控制食品中耐藥性E. coli和研究抗耐藥菌生物制劑提供一定的理論基礎。