具有透明質酸酶抑制活性益生菌的體外篩選及鑒定

雷文平，周 輝，陳 綺，周杏榮，吳 坤，汪家琦，劉成國,*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.澳優乳業（中國）有限公司，湖南 長沙 410200）

近年來，過敏性疾病日益增加，誘發過敏反應的因素也持續增多，其已屬于常見的多發性病癥[1-2]。過敏是由于外源物質進入人體，機體的免疫系統將此類物質識別為異物，致使免疫系統紊亂，引起過敏、炎癥等癥狀[3]。過敏反應根據其機理可分為I、II、III和IV型，絕大部分過敏疾病是與體內透明質酸酶活性相關的I型過敏反應；透明質酸酶是降解透明質酸的水解酶，是機體結締組織細胞外基質的主要成分，與大多數由IgE介導的I型和T細胞介導的IV型過敏反應有關，因此，透明質酸酶體外抑制實驗是體外快速篩選抗過敏藥物的有效方法[4-5]。目前，過敏疾病主要以藥物治療為主或避免接觸環境和食物中過敏原；由于藥物毒副作用大，且致使過敏反應的過敏原難以確定，無法根本解決過敏癥狀[6]。

益生菌作為人體腸道中的有益微生物，能夠預防多種疾病（包括胃腸道感染、血壓或血清膽固醇升高、腫瘤和過敏等疾病）[7]。Yang Bo等[8]研究表明益生菌能夠降低通過雞卵白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏小鼠血清中OVA-IgE和OVA-IgG1含量，減少脾臟Th2相關細胞因子的釋放以及緩解腹瀉癥狀。已有研究表明乳酸菌菌株可誘導T細胞參與的一般免疫抑制，并產生可調節T細胞，從而控制過敏性炎癥[9-10]。此外，Charalambos等[11]研究發現植物乳桿菌DC 2035和2012的細胞表面特性，具備潛在的免疫調節能力，表明菌株的細胞表面特性能夠作為抗過敏益生菌篩選的指標之一。因此，本研究通過體外抗逆性、黏附性、抑菌性、體外安全性4 個指標對菌株益生特性進行評價；然后以透明質酸酶體外抑制實驗篩選具有高透明質酸酶抑制活性的益生菌并進行鑒定，旨在為菌種資源的綜合利用和益生菌抗過敏活性的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶來自南山牧業有限公司-南山牧場；金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、單核細胞性李斯特菌（ATCC 19115）、大腸桿菌（CGMCC 9181）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGG，LGG）由湖南農業大學食品科技學院實驗室提供。

血平板、生物胺試劑盒、MRS（Man Rogosa Sharpe）肉湯、瓊脂、革蘭氏染色試劑盒、牛膽鹽 廣東環凱微生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 000～3 500 U/g）、牛磺膽鹽 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（≥50 000 U/g） 國藥集團化學試劑有限公司；抗生素試劑盒（20 種） 杭州微生物試劑有限公司；透明質酸酶（≥300 U/g）、透明質酸鈉 上海瑞永生物科技有限公司；DNA細菌提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

GZ-400-S恒溫培養箱 韶關市廣智科技設備有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺 蘇州凈化有限公司；BKQ-B50II全自動高壓蒸汽滅菌鍋 山東博科科學儀器有限公司；HH-601超級恒溫水浴鍋 常州市萬豐儀器制造有限公司；TG16-WS臺式高速離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；HF90二氧化碳培養箱 力康生物醫療科技控股有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離及菌懸液的制備

乳酸菌的分離：將從湖南山區高海拔牧場（南山牧場，平均海拔＞1 760 m）所采集的牛奶樣品以10 倍系列梯度進行稀釋，并涂布于MRS固體（含0.5 g/100 mL CaCO3）平板上，于37 ℃培養48 h。選取具有乳酸菌典型菌落形態、溶鈣圈和革蘭氏染色呈現陽性的菌株進行劃線純化，并編號保存。

菌懸液的制備：將分離保藏的菌株用MRS液體培養基于37 ℃培養24 h，活化2 代，在4 ℃、9 800×g條件下離心3 min；并用無菌生理鹽水洗滌2 次，重懸，使菌懸液OD600nm值為0.8。

1.3.2 耐酸和耐膽鹽實驗

將菌懸液以3%接種量分別接種于pH 2和含3.0 g/L牛膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃培養12 h，觀測菌液是否渾濁，選出培養基均渾濁的菌株[12]。

1.3.3 模擬胃腸液實驗

分別向4.5 mL的無菌模擬胃液和腸液中加入0.5 mL的菌懸液，混合均勻，于37 ℃孵育3 h，并采用平板計數法分別計算0 h和3 h的活菌數。其中人工胃液和腸液參照文獻[13]進行配制，并以LGG作為對照。菌株存活率計算如式（1）所示：

1.3.4 膽鹽水解酶活性和抗菌活性

膽鹽水解酶活性：將牛津杯放置于含有3 g/L牛磺膽鹽的MRS固體培養基上，并加入200 μL的菌懸液，于37 ℃培養72 h，觀察是否具有透明圈產生，根據圈透明度大小及透明度判定其膽鹽水解酶活性；并以植物乳桿菌WCFS1為陽性對照菌株。

抗菌活性采用牛津杯法[14]進行測定，以大腸桿菌和單核細胞性李斯特菌為指示菌株。

1.3.5 菌株表面特性

1.3.5.1 自聚集

將1 mL菌懸液用旋渦混合儀渦旋10 s，并在37 ℃孵育5 h，輕取200 μL上層懸液，測定600 nm波長處的吸光度，以LGG為對照菌株。其自聚集計算如式（2）所示：

式中：A1為處理5 h的吸光度；A0為初始菌懸液的吸光度。

1.3.5.2 共聚集

分別以單核細胞性李斯特菌和大腸桿菌對分離菌株的共聚集能力進行評價；將等體積的篩選菌株和致病菌菌懸液混合，渦旋混合儀振蕩10 s，在37 ℃孵育5 h后，輕取200 μL上層懸液，測定600 nm波長處的吸光度（A混），以LGG為對照菌株。其共聚集能力計算如式（3）所示：

式中：A2和A3分別為受試菌與致病菌菌懸液單獨處理5 h的吸光度。

1.3.5.3 疏水性

參照文獻[15]的方法進行測定，其中有機試劑為十六烷和乙酸乙酯。

1.3.6 Caco-2細胞黏附

細胞培養：將液氮保存的Caco-2細胞快速解凍，轉入培養瓶中，加入含10%胎牛血清的伯克改良伊格爾（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）高糖培養基，并于5% CO2、37 ℃培養箱中培養。每2 d換液，當細胞的融合度達到80%～90%時傳代培養，3 次傳代進行實驗。

黏附實驗[16]：向6 孔細胞培養板中轉入1 mL傳代培養3 次的Caco-2細胞懸液（5×104cells/mL），并于5% CO2、37 ℃培養箱中培養，直至細胞長至單層。將培養基吸出，用無菌磷酸鹽緩沖液洗2 次，加入菌懸液于二氧化碳培養箱中孵育2 h；然后除去培養板各孔的懸液，無菌磷酸鹽緩沖液洗3 次以除去未黏附的菌體，細胞刮獲取細胞，采用血球計數板測定每孔的Caco-2細胞數和平板計數法計算黏附細菌數。黏附能力計算如式（4）所示：

1.3.7 安全性評價

溶血性：將受試菌株菌懸液點種于血瓊脂平板上，并在37 ℃孵育48 h，然后觀察菌株的溶血現象。

抗生素敏感性和產生物胺：使用含有20 種抗生素的藥物敏感性片劑試劑盒確定分離株的抗生素敏感性；通過賴氨酸脫羧酶試劑盒測試菌株產生生物胺的潛力。

1.3.8 透明質酸酶體外抑制分析

參照Elson-Morgan法[17]稍作修改，向試管中加入0.1 mL 2.5 mmol/L的CaCl2和0.5 mL 600 U/mL的透明質酸酶，37 ℃處理20 min；加菌懸液0.5 mL，37 ℃處理20 min；加入0.5 mL 0.5 mg/mL的透明質酸鈉溶液，37 ℃處理30 min；常溫靜置5 min，將入0.5 mL乙酰丙酮溶液（1.4 mL乙酰丙酮溶于20 mL 1.0 mol/L的Na2CO3溶液，現用現配）和0.1 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，沸水浴15 min，立即冰浴5 min；加入1 mL埃爾利希試劑（稱取0.8 g的對二甲氨基苯甲醛溶于15 mL的濃鹽酸和15 mL無水乙醇中，現用現配），常溫顯色20 min，于530 nm波長處測定其吸光度，以LGG為對照菌株。抑制率計算如式（5）所示：

式中：A為對照組吸光度（醋酸緩沖液取代菌懸液）；B為空白組吸光度（醋酸緩沖液取代酶溶液和菌懸液）；C為實驗組吸光度；D為試樣空白組吸光度（醋酸緩沖液取代酶溶液）。

1.3.9 16S rDNA菌株鑒定

將過夜培養的受試菌株用TIANmp細菌DNA提取試劑盒提取總DNA。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）體系為：2 μL Taq緩沖液，0.4 μL Taq酶，0.5 μL上引物（27f/1512r），2 μL樣品DNA，1.6 μL dNTPs和13 μL雙蒸餾水。PCR產物由華大基因進行測序。然后使用BLAST算法在GenBank數據庫中對序列進行匹配，并利用MEGA 5軟件繪制系統發育樹。

1.4 數據統計

采用Excel 2010軟件進行數據統計分析，以SPSS Statistics 21進行方差分析（ANOVA）和最小顯著差異多重比較，P＜0.05，差異顯著；使用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 菌株分離及耐酸耐膽鹽結果

通過MRS培養基分離和革蘭氏染色，從3 個牛奶樣品中分離出50 株革蘭氏陽性菌株，其中菌株L02、L08、L10、L11和L15在酸和高膽鹽環境中表現出良好耐受性，將該5 株菌進行下一步研究。部分菌株菌落圖和鏡檢圖見圖1。

圖1 菌株菌落圖和顯微鏡檢圖Fig. 1 Colony morphology and micrographs of isolates

2.2 菌株對模擬胃腸液的耐受性結果

圖2 分離菌株對模擬胃腸液的耐受性Fig. 2 Resistance of isolates to simulated gastrointestinal fluids

益生菌在經受模擬胃腸液后能夠存活足夠數量的能力是菌株進入人體定植必要條件[18]。由圖2可知，所有菌株在模擬胃腸液中表現出較高存活率，均大于60%，其中菌株L15在模擬胃液和腸液中的存活率最高分別為（103.884±2.722）%和（92.785±1.122）%，顯著高于其他菌株（P＜0.05）；與對照菌株LGG相比，菌株L02和L10也具有較好耐受性。同時，研究表明由于菌株或物種的特異性，不同菌株對胃腸液的耐受性存在顯著差異（P＜0.05），并且在胃腸道中的存活濃度高于107CFU/g（糞便質量計），才能夠發揮對宿主的益生效果；因此，通過體外模擬胃腸道環境篩選高存活率益生菌具有重要意義[19]。

2.3 菌株膽鹽水解酶活性和抗菌活性

表1 菌株膽鹽水解酶活性Table 1 Bile salt hydrolase activity of isolates

由表1可知，所有菌株具有膽鹽水解酶活性，且與對照菌株WCFS1相比，具有相近的活性，而菌株L08并未表現出膽鹽水解酶活性；雖然膽鹽水解酶活性與益生菌耐受腸道膽鹽有一定相關性，但有研究表明并不是菌株耐受膽鹽的唯一指標，需要研究其耐受機制[20]；同時，也有研究表明膽鹽水解活性與益生菌的膽固醇清除有關[21]；因此，可作為篩選具有降膽固醇潛力的益生菌參照指標。

表2 分離菌株抗菌活性Table 2 Antibacterial activities of isolates

益生菌抗菌活性是預防宿主被病原菌感染的基礎。由表2可知，所有菌株對大腸桿菌和單核細胞性李斯特菌均有抑制作用，表明所篩選菌株可能能夠抑制大部分革蘭氏陽性和陰性病原菌；其中菌株L02、L08和L15對2 株致病菌表現出較強抑菌活性，其抑菌圈直徑均大于11.000 mm。雖然所有菌株具有抑菌活性，但菌株的抗菌能力主要是由于自產有機酸、細菌素和過氧化氫等物質，具體抗菌物質的性質仍然未知。因此，有必要進一步研究其具體組成[22]。

2.4 菌株表面特性

圖3 分離菌株的聚集能力Fig. 3 Aggregation abilities of isolates

從圖3 可以看出，由于菌株表面特異性，不同菌株間的自聚集能力差異顯著（P＜0.05），其值在（21.521±5.472）%～（89.298±1.636）%之間，表明這些菌株在人腸道中具有潛在的黏附和定植能力。其中菌株L15具有最高自聚集能力（（89.298±1.636）%），這一結果與Gómez等[23]報道一致。與對照菌株LGG相比，所有受試菌株對大腸桿菌和單核細胞性李斯特菌2 株致病菌表現出接近或高于LGG的共聚集能力，表明菌株對不同致病菌具有較強的共聚集能力，研究表明具有高共聚集能力的益生菌可以通過競爭腸上皮細胞上的結合位點來防止不同的病原體黏附[24]。因此，益生菌可能是減少病原菌定植并預防感染的候選者。

圖4 分離菌株的疏水性Fig. 4 Hydrophobicity of isolates

疏水性是益生菌細胞黏附腸道上皮細胞的重要指標之一。由圖4可知，通過十六烷和乙酸乙酯兩種有機試劑處理，不同菌株間的疏水性差異顯著（P＜0.05），菌株L02和L15在兩種有機試劑中的疏水性均顯著（P＜0.05）高于其他菌株，均高于60%；并且與LGG相比，菌株L11也具有較好疏水性。其中菌株L08僅對十六烷表現出較高疏水性，而對乙酸乙酯表現出最低疏水能力；因十六烷是菌株表面疏水性的表現，而乙酸乙酯反映菌株的表面Lewis酸堿性，表明菌株表面呈現堿性[25]；相關研究指出疏水性受菌株的年齡、表面化學成分以及培養物組成的影響，所以疏水性并無標準值；但高疏水性是益生菌黏附特性的一個積極特征[26]。

2.5 菌株對Caco-2細胞黏附結果

圖5 分離菌株的黏附能力Fig. 5 Adhesion abilities of isolates

益生菌對腸道表面的黏附和人胃腸道的定植是其發揮益生作用的至關重要條件。由圖5可知，菌株L10、L02和L15表現出良好的黏附特性，均高于對照益生菌LGG（（2.660±0.751）CFU/cell）；其中菌株L10具有最高黏附能力（（46.001±17.962）CFU/cell）；但是菌株L11表現出較低黏附力，僅為（1.416±0.101）CFU/cell，可能取決于不同表面決定因素（包括疏水、靜電相互作用、空間力和表面分子）[27]。同時，不同研究結果表現出不同的細胞黏附性能，可能歸因于Caco-2細胞的培養環境和用于分析的方法[28-29]。 此外，高黏附力的益生菌菌株可能在人類胃腸道中持續更長的時間；并且與非黏附微生物相比，它們具有更好的代謝和免疫調節作用。

2.6 菌株安全性評價

表3 菌株溶血性和產生物胺分析Table 3 Hemolytic potential and biogenic amine-producing abilities of isolates

表4 菌株抗生素敏感性Table 4 Antibiotic sensitivities of isolates

為了能夠保證所篩選菌株能安全地應用于食品加工，進一步從溶血性、產生物胺和抗生素敏感性等方面評價菌株的安全性。由表3可知，受試菌對并未表現出α和β溶血作用，產生物胺呈現陰性；通常益生菌中應避免在致病細菌（如鏈球菌和葡萄球菌等）中出現的此特征。由表4可知，菌株對20 種抗生素的敏感性存在差異性，所有菌株對卡那霉素均不敏感，且對丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素和新霉素敏感性較弱，可能是因為此類抗生素僅對革蘭氏陰性菌株具有抑制作用；而大部分菌株對其他抗生素較敏感；本實驗結果與之前相關學者報道較一致[30-32]。此外，菌株抗耐藥性可以是固有或獲得性的，這使得細菌耐藥性可能在相關動物中發生耐藥性基因的遷移[33]。因此，所篩選菌株能初步確定在使用上無致病性。

2.7 菌株透明質酸酶體外抑制分析

圖6 分離菌株透明質酸酶抑制活性Fig. 6 Hyaluronidase inhibitory activities of isolates

研究表明透明質酸酶能明顯促進細胞的遷移和增殖，也會參與到部分惡性腫瘤細胞的繁殖，其與炎癥、過敏較強相關性，是體外篩選抗過敏藥物的有效方法[34]。由圖6可知，所篩選菌株具有較高的透明質酸酶抑制活性，且存在顯著差異（P＜0.05）；其抑制率在（49.261±1.262）%～（80.404±1.262）%之間，菌株L08表現出最高抑制活性；并且相比陽性菌株LGG，菌株L02和L11呈現相近的抑制率，分別為（68.974±0.808）%和（71.54±1.654）%；表明所篩選菌株具有潛在抗過敏活性。這可能與細胞表面特性（如共聚集、疏水性和細胞黏附性等）有一定相關性，并且研究發現植物乳桿菌L67的糖蛋白可抑制BPA刺激的RBL-2H3細胞的脫粒和組胺的釋放以及細胞中TNF-α和IL-4的表達[11,35]。因此，有必要結合益生菌表面特性進一步證明菌株的抗過敏能力。

2.8 菌株16S rDNA鑒定結果

圖7 菌株系統發育樹Fig. 7 Phylogenetic tree of isolates

將所篩選菌株的PCR擴增產物，送至華大基因進行測序；測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，所有菌株與植物乳桿菌同源性高于98%，表明上述菌株均為植物乳桿菌；并且從系統發育樹可以看出（圖7），所篩選菌株與植物乳桿菌在同一分支上；因此，可進一步確定篩選菌株均為植物乳桿菌。

3 結 論

本研究通過菌株益生特性體外評價和透明質酸酶體外抑制實驗，快速篩選具有抗過敏潛能的益生菌。分離出的50 株菌中5 株表現出對酸和膽鹽耐受；相比較對照菌株LGG，這5 株菌均具備良好的體外抗逆性和高黏附性，并初步判定為安全菌株，能有效地在人體內發揮其功能特性；同時，5 株菌株的透明質酸酶抑制活性高于40%，在抗過敏方面具有潛在功效；其中菌株L02和L15各方面均相對突出，且鑒定結果均為植物乳桿菌。由于受試樣品均為菌株菌體，且相關研究表明其表面特性與菌株抗過敏活性有關，因此，菌株表面性質與治療過敏疾病的相關性有待進一步研究。