傳統發酵泡菜中乳酸菌種群組成及優良菌株產酸耐酸特性分析

羅 強，李幸洋，陳煉紅，張 明，劉 巧，張大偉，羅 璠,*

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，青藏高原動物遺傳資源保護與利用國家教育部重點實驗室，四川 成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041）

發酵蔬菜是以乳酸菌主導厭氧發酵而生產加工的傳統食品[1]，在我國有悠久的歷史。常見的發酵蔬菜制品包括咸菜、泡菜、醬菜等。蔬菜經過發酵處理后，不僅能延長新鮮蔬菜的貯藏期[2]，還能改善風味，增進食欲，提升蔬菜的營養價值[3]，同時也具有降低血清膽固醇、調節腸道菌群、抗氧化等[4-6]保健作用。在我國北方地區，以新鮮白菜為主要材料，用鹽水長時間腌漬而成的發酵泡菜，是當地居民主要的手工自制發酵食品之一。

自制發酵蔬菜多數采用天然接種，由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等多菌種混合發酵而成，其中乳酸菌起到重要作用。前期研究表明，成品北方泡菜中含有豐富的乳酸菌資源，涉及十多個屬一百多個種，其中以乳桿菌屬最為豐富[7]。蔬菜在發酵過程中也表現出明顯的菌群更替現象，多數研究表明發酵前期以腸膜明串珠菌為優勢菌群，后期以短乳桿菌和植物乳桿菌為優勢菌[8-9]，乳桿菌屬作為終止發酵的主要菌群使得發酵蔬菜快速成熟，其中蘊含大量的產酸耐酸優質菌種。金成武等[10]從市售泡菜中篩選到1 株植物乳桿菌Q2，其24 h發酵液pH值達到3.79；王惋等[11]從黑龍江農戶家中所發酵的自然泡菜中，以pH 3.0為篩選條件篩選了一批酸耐受性良好的乳酸菌株。這些產酸和耐酸性能優良的菌株在各個領域均能得到廣泛應用：在食品行業中，菌株較強的發酵產酸能力能夠顯著縮短工業化發酵進程，提升生產效率，含有強耐酸性乳酸菌的發酵食品經食用后能夠耐受酸性的腸胃環境，更利于發揮乳酸菌的益生性質；在飼料行業中，產酸和耐酸性能優異的乳酸菌株能夠制作益生菌飼料，經動物食用并定值后，產生的代謝物能更好抑制腸道內病原菌，調節腸道菌群，提升動物免疫力[12]，對于動物生長性能也有較大提升[13]。因此，篩選具有優質產酸耐酸性能的乳酸菌株具有較明顯的應用價值。

本研究通過對來自遼寧、河南、吉林及內蒙古自治區等不同地區采集的20 份泡菜樣品進行乳酸菌的分離與鑒定，研究不同地區泡菜中微生物菌群的多樣性，通過產酸、耐酸實驗，篩選一批產酸和耐酸能力優異的菌株，以期為食品及飼料添加劑中優質乳酸菌資源的開發提供后備菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樣品分別來自遼寧、河南、吉林和內蒙古自治區4 個地區使用當地傳統工藝制作而成的自然發酵農家泡菜，每個地區采集5 份樣品，共計20 份樣品。

1.1.2 培養基與試劑

MRS肉湯培養基和BCP產酸菌計數培養基購自青島海博生物技術有限公司，向MRS肉湯培養基中加入1.5%瓊脂制成培養平板用于菌株分離純化。

2×Taq Master Mix 即用型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）預混液 康潤生物科技有限公司；1×TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 8.0）；引物Eu27F、1495R、rpoA-21-F和rpoA-23-R由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；SuperRed/GelRed核酸染料 北京白鯊易科技有限公司；胃蛋白酶（酶活力10 000 U/g）美國Sigma公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ST16R高速冷凍離心機、NanoDrop2000微量核酸測定儀 賽默飛世爾科技有限公司；GH6000電熱恒溫培養箱天津泰斯特設備有限公司；ETC811 PCR儀 北京東勝創新生物科技有限公司；Tanon2500凝膠成像系統中國天能公司；Vortex-BE1旋渦混合器 江蘇其林貝爾儀器制造有限公司；UV1900紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；R40-IIB2超凈工作臺 中國青島海爾有限公司；雷磁PHSJ-3F精密pH計 上海精密科學儀器有限公司；GI54DW高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；AE-30生物顯微鏡 麥克奧迪有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜樣品采集

選取發酵后期且風味良好的農家天然發酵泡菜，將罐中蔬菜與汁液充分搖晃混勻后，用無菌移液器吸取適量泡菜汁液轉移至滅菌采樣瓶中，置于冰上低溫存放并轉運至實驗室。

1.3.2 泡菜樣品中產酸菌的計數和分離

充分振蕩采樣瓶，吸取10 mL泡菜汁加入含有90 mL 0.85%（V/V）無菌生理鹽水的三角瓶中充分混勻，采用10 倍梯度稀釋法對樣品進行稀釋，吸取10-4～10-7稀釋度的稀釋液100 μL涂布于BCP固體培養基中，每個稀釋度重復3 次，37 ℃培養24～48 h。選取菌落數適宜的稀釋度平板，對產生黃色圈的菌落進行計數。

1.3.3 乳酸菌的純化

挑取產生黃色圈的菌落于MRS固體平板上進行多次平板劃線培養直至得到單菌落，挑取單個菌落進行過氧化氫酶實驗和革蘭氏染色。凡革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株作為疑似乳酸菌，增菌培養后于-20 ℃凍存于含有體積分數25%甘油的MRS培養基中[14]。

1.3.4 16S rDNA基因同源性分析

疑似乳酸菌株經活化后使用微波提取法[15]抽提總DNA 并擴增其16SrDNA 基因序列。16SrDNA 擴增引物：正向引物EU 27 F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1495R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’[16]。PCR擴增體系（25 μL）：上下游引物各2 μL（10 pmol/μL），模板DNA（100 ng/μL）1 μL，無菌雙蒸水7.5 μL，2×TaqPCR MasterMix預混酶12.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環30 次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫備用[17]。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成序列測定。將所得序列在NCBI數據庫中利用BLAST工具與GenBank數據庫中已知菌株的16S rDNA基因序列進行比對鑒定。當序列相似度達到97%時，判定為同一個屬，而序列相似度達到99%時，則判定為同一個種[18]。其中對于基因序列高度相似的腸球菌屬只鑒定至屬水平，后續待篩選得到優良菌株后對其種屬做進一步鑒定。

1.3.5 產酸能力初步篩選

將已鑒定種屬的乳酸菌株37 ℃活化培養18 h后，以2%接種量接種到MRS液體培養基（pH 6.50）中，37 ℃靜置培養24 h，測定發酵液pH值。

1.3.6 產酸特性分析[19]

選取1.3.5節篩選得到的發酵液pH值低于4.0的乳酸菌株，37 ℃活化18 h，6 000 r/min離心10 min得到菌體，使用0.9%無菌生理鹽水重懸并調節菌液濃度為1.0×108CFU/mL，以2%接種量接種于100 mL MRS液體培養基（pH 6.50）中于37 ℃培養，在第2、4、6、8、10、12、18、24小時測定發酵液pH值并繪制變化曲線。

1.3.7 乳酸菌株的耐酸能力測定

參照中國藥典配制人工胃液[20]，菌株耐酸能力測定參照文獻[21]并加以修改，挑取產酸性能較好的乳酸菌株活化18 h，吸取菌液10 mL于離心管中，6 000 r/min離心10 min后棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌2 次，在菌體中加入10 mL人工胃液，旋渦混勻后于37 ℃、200 r/min搖床溫浴，在0 h和3 h測定人工胃液處理前后的活菌數量，根據下式計算菌株存活率：

式中：N1為經過人工胃液處理后乳酸菌數量；N0為人工胃液處理前的乳酸菌數量。

1.3.8 腸球菌屬菌株rpoA管家基因的序列同源性分析

通過16S rDNA序列測定不能準確區分腸球菌的種類，因此使用管家基因rpoA（RNA polymeraseα-chain）對耐酸性能優異的腸球菌屬乳酸菌進一步分類鑒定，引物序列、退火溫度及擴增位點見表1。

表1 管家基因rpoA的引物序列和退火溫度Table 1 Primer sequences and annealing temperatures for rpoA used in this study

PCR擴增體系：基因組DNA 1 μL，2×TaqMaster Mix預混酶12.5 μL，正反引物各1 μL，無菌雙蒸水7.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min，3 次循環（95 ℃變性60 s，46 ℃退火75 s，72 ℃延伸75 s），30 次循環（95 ℃變性35 s，48 ℃退火75 s，72 ℃延伸75 s），72 ℃延伸7 min，4 ℃保存備用[23]。取5 μL擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴增產物大小。序列測定、同源性分析以及系統發育樹構建參照步驟1.3.4節進行。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 不同地區泡菜汁中產酸菌的分離與計數

通過BCP平板對4 個不同地區來源的樣品中產酸菌數量進行計數，結果如表2所示。不同來源的樣品中產酸菌數量具有一定差別，其中來源于吉林省的5 份樣品平均產酸活菌數明顯高于其他地區，前期測定結果也顯示吉林樣品的pH值最低。

表2 不同地區來源的發酵泡菜中產酸菌數量Table 2 Number of lactic acid bacteria in traditional pickles from different regions

2.2 16S rDNA序列鑒定與菌群組成

采用微波法提取菌株基因組DNA后經微量核酸檢測儀檢測，得到DNA的OD260nm/OD280nm在1.8～2.1之間，符合擴增模板要求。將DNA質量濃度調節至100 mg/L作為擴增模板，對16S rDNA基因序列進行PCR擴增。擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物檢測。如圖1所示，各泳道在1 500 bp左右位置出現明顯可見的亮帶，無明顯非特異性擴增現象，符合測序要求。

圖1 部分乳酸菌株的16S rDNA PCR擴增產物凝膠電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of PCR amplification products of 16S rDNA of selected strains of lactic acid bacteria

經過16S rDNA序列分析和BLAST同源性比對，20 份樣品中共分離出4 個乳酸菌屬共計435 株菌。在所有分離株中，乳桿菌屬（Lactobacillus）6 個種共394 株（占總菌數的90.57%），占據了分離株的絕對比例，腸球菌屬（Enterococcus）共計38 株（占總菌數的8.74%），另外還從遼寧和河南地區樣品中各分離得到2 株腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和1 株暹羅片球菌（Pediococcus siamensis）。

圖2 不同地區泡菜源分離出的乳酸菌多樣性Fig. 2 Diversity of lactic acid bacteria isolated from pickles from different areas

根據各地區泡菜發酵后期的乳酸菌菌群組成情況建立了乳酸菌多樣性柱狀堆積圖。如圖2所示，遼寧和河南地區的泡菜樣品中菌群組成最為豐富，共分離出6 種乳酸菌，吉林次之（4 種），而內蒙古地區只分離出3 種乳酸菌，其乳酸菌群豐富度明顯少于其他地區。4 個地區樣品中均分離得到短乳桿菌（L. brevis）、植物乳桿菌（L. plantarum）和腸球菌屬。其中短乳桿菌在4 個地區的樣品中均占據最大比例，在各地區所占比例在58.59%～82.61%之間，是發酵后期泡菜中的優勢菌群，與前期研究一致[24-25]。另外腸球菌屬在4 個地區的樣品中均有檢出，與相關報道相似[26-27]，但不同的是本研究篩選到的腸球菌屬除在吉林來源的樣品中含量較高，占據其總分離株的22.22%外，在其他3 個地區的樣品中含量均較低，不屬于優勢菌群，且它們均是在成熟泡菜中篩選得到，說明耐酸能力較強。有研究表明[28]，泡菜中的腸球菌屬具有較為出色的亞硝酸鹽降解能力和抗氧化能力，能夠控制發酵泡菜中的亞硝酸鹽含量，對提高發酵泡菜的益生性都有明顯的作用。

本研究顯示4 個不同地區的泡菜中優勢菌群比較一致，但菌群組成上有較為明顯的差別，該結果與李欣[29]、孫慧君[30]等的研究結果相似。這可能與泡菜加工時的外界因素，如溫度、鹽度、工藝、品種等有關[31]。

2.3 高產酸菌株篩選結果

產酸能力是乳酸菌活力良好的重要特征之一，測定435 株已鑒定乳酸菌株發酵24 h的發酵液pH值，結果如圖3所示。435 株乳酸菌中，24 h發酵液pH值集中在3.50～5.00之間，其中pH值在4.00～4.50之間的菌株最多，pH值在3.50～4.00之間有87 株，另外只有11 株菌的24 h發酵液pH值低于3.5。在24 h發酵液pH值低于4.0的98 株菌中，乳桿菌屬約占94.9%。

圖3 全部乳酸菌株24 h發酵液pH值分布情況Fig. 3 Grouping of 435 strains of lactic acid bacteria by pH after 24 h culture

2.4 產酸曲線

根據產酸初篩結果，選取所有發酵液pH值低于4.0的乳酸菌株于37 ℃培養24 h，測定產酸曲線。結果顯示，多數菌株在培養前期pH值均快速下降，在12 h左右pH值變化減緩，24 h的終pH值在3.3～4.0之間。通過測定所有98 株菌產酸曲線發現，腸膜明串珠菌LR-90和短乳酸桿菌NR-20的產酸能力最強。最終挑選出29 株產酸快、終pH值低于3.6的菌株用于后續耐酸實驗。其中有17 株來源于吉林地區，圖4為部分菌株的產酸曲線。

圖4 菌株24 h的產酸曲線Fig. 4 Acid production curves of six selected strains over 24 h

2.5 耐酸菌株的篩選結果

將29 株高產酸乳酸菌在pH 2.0模擬人工胃液環境下孵育3 h進行耐酸實驗，結果顯示，菌株的存活率范圍為0%～93%，呈現了較大的差異。存活率在70%以上的乳酸菌共9 株，如表3所示，占高產酸總菌數的22.5%，其中植物乳桿菌NR-11和LR-13、棒狀乳桿菌LR-43的存活率在90%以上，表現出對模擬胃酸較強的耐受性。

表3 pH 2.0模擬胃液環境下菌株的存活率Table 3 Effect of simulated gastric fluid at pH 2.0 on survival rate of 29 acid-producing strains of lactic acid bacteria

結合產酸實驗發現，產酸能力較強的LR-90，耐酸能力不表現明顯增強，在人工胃液處理3 h后，存活率不到70%，而耐酸能力較強的NR-11、LR-13、LR-43產酸能力并不具有明顯優勢，這與林龍鎮等[32]的研究一致。因此，菌株產酸能力與耐酸能力之間有否相關性還有待深入探討。

2.6 rpoA基因同源性分析

由于在耐酸性實驗中，2 株腸球菌屬菌株JR-14和NR-59的存活率較高，也體現出較強的研究價值，因此通過rpoA管家基因測序將其鑒定至種水平。根據rpoA基因序列測序結果，菌株NR-59和JR-14菌株E. faeciumSRCM103470的rpoA基因序列同源性分別為100%和99.83%，圖5展示了通過rpoA管家基因序列所構建的系統發育樹。結合16S rDNA序列和2 株腸球菌屬乳酸菌在rpoA管家基因系統發育樹中的位置，確定了2 株菌為屎腸球菌（E. faecium）。

圖5 2 株腸球菌屬乳酸菌rpoA序列的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on rpoA sequences of two strains of Enterococcus

3 結 論

采用BCP產酸培養基對北方4 個不同地區來源的20 份泡菜樣品進行菌種篩選和計數，初步分離得到435 株疑似乳酸菌，經過16S rDNA序列同源性分析，共得到乳桿菌屬6 個種共394 株，腸球菌屬共38 株，2 株腸膜明串珠菌和1 株暹羅片球菌。

4 個地區泡菜樣品中乳酸菌群在種水平上表現出地區差異性，來源于遼寧和河南地區的泡菜樣品乳酸菌多樣性較高，來源于吉林的樣品中產酸菌最多，以乳桿菌屬為代表的乳酸菌群主導了各地區發酵蔬菜的成熟，其中以短乳桿菌所占比例最高，是各地區泡菜中的最優勢菌種。

進一步對435 株乳酸菌產酸初篩和產酸曲線測定，以及在pH 2.0人工胃液下進行耐酸性實驗，最終篩選得到9 株產酸和耐酸性質優良的乳酸菌株，其中包括7 株乳桿菌和2 株腸球菌，通過rpoA管家基因序列對腸球菌進一步鑒定，發現2 株腸球菌均為屎腸球菌。本實驗篩選得到的9 株乳酸菌產酸耐酸能力強，是進一步深入研究與應用的備選菌株。