利用CRISPRi 技術構建乙醛酸生物合成Corynebacterium glutamicum工 程菌

梁詠思，沈凱佳，范許云，韓武洋,2，李天明,*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.舒泰神（北京）生物制藥股份有限公司，北京 100000）

乙醛酸是醛酸家族中分子質量最小的物質，是生物體三羧酸（tricarboxylic acid cycle，TCA）循環和乙醛酸循環中重要的有機酸，影響生物體的代謝平衡，其衍生品多達數十種，其中典型的有香蘭素、乙基香蘭素、尿囊素、對羥基苯丙氨酸、對羥基苯乙酰胺等[1]。這些衍生物被廣泛應用于食品添加劑、糕點、糖果、烘烤食品、煙酒、香料、化妝品以及醫藥等行業[2-3]。隨著乙醛酸需求量的增加，化學法生產乙醛酸帶來的污染日益嚴重，因此，利用生物法合成乙醛酸成為重要途徑。

圖1 C. glutamicum ATCC 13032代謝途徑Fig. 1 C. glutamicum ATCC 13032 metabolic pathways

谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）作為食品安全級的微生物，具有易培養、不產孢子、產率高、生物安全[4]等優點。隨著C. glutamicumATCC 13032全基因組測序的完成[5]和組學數據的積累[6]，對其進行工程化改造得以實現[7-8]。在C. glutamicum糖酵解途徑和TCA循環過程中，丙酮酸、乳酸、檸檬酸、異檸檬酸、乙醛酸和蘋果酸之間存在復雜的網絡系統，其代謝途徑如圖1所示，它們錯綜復雜并且相互關聯[9]，研究人員對其進行定向改造，使之具有更高的生產效率。常規的代謝工程技術一般是加強合成代謝途徑，阻斷競爭代謝途徑及支流代謝途徑，從而提高產品合成效率，但是敲除一些競爭途徑的關鍵基因常常會影響細胞生長[10-11]?；赗NA引導的DNA核酸內切酶II型規律間隔成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9系統的CRISPRi技術，可以根據需要調節基因轉錄和蛋白表達水平，進而優化代謝網絡，提高合成效率。Cleto等[12]應用CRISPRi技術，對C. glutamicum中pgi、pck、pyk三個基因表達強度進行調控，使pgi、pck的表達強度下調97%，pyk基因的表達強度下調98%，發酵后得到的代謝產物L-賴氨酸和L-谷氨酸的產量與基因敲除時的水平相當。劉旭峰等[13]應用CRISPRi技術對大腸桿菌（Escherichia coli）中3 個關鍵基因zwf、pfkA、gltA的表達強度分別進行下調，最終使蘇氨酸產率均提升了約15%，而菌體的生長并沒有受到顯著影響。CRISPRi體系由失去核酸內切酶活性的dCas9蛋白和sgRNA兩個組件構成[14]，其中sgRNA由3 部分組成：20 nt目標基因特定核苷酸區域的識別序列、42 nt dCas9蛋白結合序列以及40 nt轉錄終止子序列[15-17]。CRISPRi工作機制為sgRNA引導dCas9蛋白結合在DNA的特定位置時，三者形成的復合物能夠形成空間位阻，實現調節基因表達水平的目的。CRISPRi技術具有靈活高效的特點，被廣泛應用于代謝工程和合成生物學等領域[18-24]，現如今，CRISPRi已被證明能在多個物種間發揮抑制作用，例如大腸桿菌、分歧桿菌、釀酒酵母以及動植物細胞等[25-27]。

本研究以C. glutamicumATCC 13032為出發菌株，敲除其支流代謝關鍵酶乳酸脫氫酶合成基因lldh，并建立CRISPRi調控體系，利用該體系下調C. glutamicum支流代謝中的關鍵酶異檸檬酸脫氫酶合成基因icd和蘋果酸合成酶合成基因ms的表達強度，同時過表達異檸檬酸裂合酶合成基因icl，使乙醛酸得到積累，減少副產物的生成，以期為C. glutamicum工業生產乙醛酸研究提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

表1 本實驗所用的菌株、質粒Table 1 Information about the strains and plasmids used in this study

1.1.2 試劑

High-Fidelity DNA聚合酶 北京全式金生物制品公司；T4 DNA連接酶、限制性內切酶 NEB（北京）有限公司；基因組提取試劑盒、質粒小提中量試劑盒、超薄DNA產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器與設備

T100 Thermal Cycler PCR擴增儀、Gel DOC XR全自動凝膠成像儀、Centrifuge 5418R高速冷凍離心機 美國伯樂公司；PowerWave XS2酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；1200 Infinity高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；MiniSpin臺式高速離心機 德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 培養條件與培養基

E. coli培養條件：LB培養基，37 ℃培養，氨芐青霉素工作質量濃度為100 μg/L，卡那霉素工作質量濃度為50 μg/L；C. glutamicumATCC 13032培養條件：37 ℃培養，卡那霉素工作質量濃度為30 μg/L。

LB培養基配方：10 g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，調pH 7左右；固體培養基則添加瓊脂粉20 g/L。孵育培養基配方：10 g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，1 g/L乙酸鈉，調pH 7左右。種子培養基配方：10 g/L玉米漿，25 g/L葡萄糖，20 g/L瓊脂。發酵培養基配方：50 g/L葡萄糖，5 g/L乙酸鈉，0.1 g/L NH4NO3，1.5 g/L KH2PO4，0.3 g/L CaCl2，0.25 g/L MgSO4，5 g/L (NH4)2SO4。

1.3.2 打靶質粒的構建

dCas9基因打靶質粒的構建：為將dCas9基因整合到基因組上，選擇C. glutamicum支流代謝中乙醛脫氫酶合成基因aldh作為其替代基因，將dCas9替換到aldh基因的相應位置，以C. glutamicum基因組為模板，分別擴增出aldh基因上下同源臂片段、啟動子sod基因片段，以實驗室保存的dCas9-Peasy質粒為模板，擴增出dCas9基因片段，通過融合PCR技術將其搭接，獲得的搭接片段與空質粒pK18mobsacB用NheI和XhoI進行雙酶切，得到的酶切產物純化，經T4連接酶于16 ℃過夜連接，轉化至E. coli TransT1感受態細胞中，獲得打靶質粒dCas9-pK18mobsacB。

icd基因和ms基因的sgRNA轉錄單元打靶質粒的構建：為敲除C. glutamicum支流代謝關鍵酶乳酸脫氫酶合成基因lldh，同時也為將icd和ms基因的sgRNA轉錄單元整合到染色體上，因此選取lldh基因的相應位置作為目的位置，將sgRNA轉錄單元替換掉lldh基因。其中，icd基因的sgRNA轉錄單元組件包括啟動子sod基因序列、20 bp的sgRNA基因序列、Cas9蛋白結合區域基因序列以及終止子rrnB基因序列；ms基因的sgRNA轉錄單元組件包括啟動子tuf基因序列、20 bp的sgRNA基因序列、Cas9蛋白結合區域基因序列以及終止子rrnB基因序列。以C. glutamicum基因組為模板擴增出lldh基因的上、下同源臂片段，通過延長引物，利用2 次PCR擴增出icd基因和ms基因的sgRNA組件，利用Golden Gate方法構建出打靶質粒icd-ms-pK18mobsacB。

icl基因過表達質粒的構建：以C. glutamicum基因組為模板擴增出啟動子sod基因片段、icl基因片段及終止子rrnB基因片段并搭接。將搭接片段與pXMJ19GZ質粒利用HindIII和BamHI進行雙酶切，按照上述方法構建獲得打靶質粒icl-pXMJ19GZ。

1.3.3 感受態細胞的制備及轉化

C. glutamicum感受態細胞制備參考Jang等[28]方法，將過夜培養的菌株按照10%接種量接種于種子培養基中搖瓶振蕩培養，使用PowerWave XS2酶標儀測定OD值，當OD600nm達到0.5～0.7時，4 ℃、4 000 r/min離心收集菌體，棄掉上清液后加入10%甘油輕輕洗滌2 次。吸取10 μL打靶質粒和40 μL的C. glutamicum感受態細胞于1.5 mL離心管中輕彈混合，轉入電轉杯，靜置5 min后開始電擊，電擊條件為電壓2.5 kV/m、電阻250 Ω、電容25 μF。電擊完成后立即向電擊杯中加入1 000 μL預熱的孵育培養基，重懸混合后轉移至1.5 mL離心管中，在恒溫加熱器中于48 ℃加熱6 min，之后30 ℃、180 r/min培養4 h。離心棄上清液后將菌液涂布在含有卡那霉素的LB固體培養基平板上，30 ℃恒溫培養48～72 h。

1.3.4 工程菌的篩選及鑒定

C. glutamicum工程菌利用蔗糖致死基因sacB反向篩選技術，通過2 次同源重組方法進行基因敲除，其原理如圖2所示。

圖2 同源重組原理示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the homologous recombination principle

以突變菌株C. glutamicum/dCas9Δaldh為例，其構建及篩選過程如下：將打靶質粒dCas9-pK18mobsacB利用電轉化轉入到野生型C. glutamicumATCC 13032菌株，48～72 h后，對在含卡那霉素的固體培養基上生長的單菌落進行分子驗證，確定打靶質粒發生第1次同源重組，已整合到染色體上。選取驗證正確的陽性單菌落轉接到孵育培養基中，30 ℃、180 r/min培養12 h，讓其在無抗生素條件下自由生長，使其發生第2次同源重組。將菌液稀釋涂布在含10%蔗糖的LB固體培養基上，30 ℃過夜培養。將長出的轉化子一一對應擴培到含10%蔗糖和卡那霉素的LB固體培養基上。在含蔗糖培養基上生長而在含卡那霉素的培養基上不生長的單菌落即為發生第2次同源重組的菌株，進一步通過菌液PCR驗證獲得陽性轉化子。按照此方法，將質粒icd-ms-pK18mobsacB轉入到C. glutamicum/dCas9Δaldh中，獲得陽性工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh。將icl基因過表達質粒iclpXMJ19GZ轉入到C. glutamicum/icd-msΔlldh中，獲得陽性工程菌C. glutamicum/icl。

1.3.5 乙醛酸檢測方法的建立

將獲得的工程菌C. glutamicum/icl與野生菌分別接種到種子培養基中，30 ℃、180 r/min搖瓶振蕩過夜培養，分別以等OD值接種到含5%葡萄糖的發酵培養基中，在相同的條件下搖瓶振蕩培養48 h，定時取樣，并測定菌體生長濃度，同時調節pH值，使之維持在7.0左右。將留存待測的樣品經8 000 r/min離心10 min后，吸取上清液用0.22 μm醋酸纖維素濾膜過濾并稀釋，利用高效液相色譜法檢測發酵液中乙醛酸的含量。檢測條件為：Agilent 1200高效液相色譜儀，紫外檢測器，BDS HYPERSIL C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動相為20 mmol/L KH2PO4（pH 2.8）和乙腈混合液，檢測波長210 nm，柱溫29 ℃，流速0.5 mL/min，進樣量20 μL。

1.4 數據及圖像處理

凝膠成像圖利用Visio軟件與PowerPoint處理并標注，生長曲線圖利用Origin 8制作。

2 結果與分析

2.1 dCas9表達盒基因置換aldh基因工程菌的構建及驗證

選取2 個轉化子對獲得的重組質粒dCas 9-pK18mobsacB進行PCR驗證。如圖3所示，dCas9表達盒基因與陽性對照條帶大小一致，說明打靶質粒構建成功。

圖3 質粒dCas9-pK18mobsacB PCR驗證Fig. 3 PCR verification of plasmid dCas9-pK18mobsacB

將打靶質粒dCas9-pK18mobsacB利用電轉化轉入到野生型C. glutamicumATCC 13032菌株，選取4 個獲得的轉化子進行菌液PCR驗證。如圖4所示，aldh基因未能擴增出，而dCas9基因與陽性對照條帶大小一致，從而說明dCas9表達盒基因置換了aldh基因的工程菌C. glutamicum/dCas9Δaldh構建成功。

圖4 工程菌C. glutamicum/dCas9Δaldh菌液PCR驗證Fig. 4 PCR verification of C. glutamicum/dCas9Δaldh

2.2 icd與ms基因sgRNA轉錄單元置換lldh基因工程菌構建及驗證

對獲得的打靶質粒icd-ms-pK18mobsacB進行酶切驗證。如圖5所示，經酶切后分別獲得5 400 bp和3 000 bp兩條片段，與pK18mobsacB質粒和icd與ms基因sgRNA轉錄單元片段大小一致，說明打靶質粒構建成功。

圖5 質粒icd-ms-pK18mobsacB酶切驗證Fig. 5 Enzymatic digestion verification of icd-ms-pK18mobsacB

將打靶質粒icd-ms-pK18mobsacB利用電轉化轉入到已驗證正確的工程菌C. glutamicum/dCas9Δaldh中，選取4 個獲得的轉化子進行菌液PCR驗證。如圖6所示，lldh基因未擴增出條帶，而icd-sgRNA基因大小、ms-sgRNA基因大小均與陽性對照條帶大小一致，從而說明icd與ms基因sgRNA轉錄單元基因置換lldh基因的工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh構建成功。

圖6 工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh菌液PCR驗證Fig. 6 PCR verification of C. glutamicum/icd-msΔlldh

2.3 過表達icl基因的工程菌構建及驗證

對獲得的表達質粒icl-pXMJ19GZ進行酶切驗證。如圖7所示，經酶切后獲得6 500 bp和1 600 bp兩條片段，與pXMJ19GZ質粒和icl基因及啟動子sod基因搭接片段大小一致，說明重組表達質粒構建成功。

圖7 質粒icl- pXMJ19GZ酶切驗證Fig. 7 Enzymatic digestion verification of icl-pXMJ19GZ

將表達質粒icl-pXMJ19GZ利用電轉化轉入到已驗證正確的工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh，隨機挑取4 個單菌落進行菌液PCR驗證。如圖8所示，擴增出的icl基因大小與陽性對照條帶大小一致，說明工程菌C. glutamicum/icl構建成功。

圖8 工程菌C. glutamicum/icl菌液PCR驗證Fig. 8 PCR verification of C. glutamicum/icl

2.4 工程菌生長狀況

工程菌與野生菌培養48 h，定時取樣，并測定菌體生長濃度。如圖9所示，野生菌和工程菌C. glutamicum/icl在0～24 h之間生長快速，24～48 h之間生長趨于平緩，二者生長趨勢幾近相同，說明敲除了aldh和lldh基因，同時沉默了icd和ms基因，并未影響菌株的糖酵解途徑和TCA循環，菌株能正常生長。

圖9 野生菌與工程菌的生長情況Fig. 9 Growth curves of wild-type and engineered bacteria

2.5 工程菌乙醛酸的發酵

為檢測工程菌發酵液中乙醛酸產量，將工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh、C. glutamicum/icl與野生菌C. glutamicumATCC 13032同時以5%葡萄糖作為碳源的發酵培養基進行發酵，連續培養48 h，期間每12 h取樣待檢測，利用高效液相色譜法檢測發酵液中乙醛酸含量。經計算達到48 h發酵終點時，野生菌發酵液中乙醛酸幾乎為0，工程菌C. glutamicum/icd-msΔlldh發酵液中乙醛酸質量濃度僅為1.05 mg/mL，而最終工程菌C. glutamicum/icl發酵液中乙醛酸質量濃度為5 mg/mL，實現了乙醛酸從無到有的過程。在最終工程菌C. glutamicum/icl的發酵過程中，0～36 h乙醛酸積累量很少，36 h后開始逐漸積累。野生菌C. glutamicumATCC 13032和最終工程菌C. glutamicum/icl發酵終點時出峰結果如圖10所示。

圖10 野生菌與工程菌發酵液液相圖譜Fig. 10 Liquid chromatograms of fermentation broths of wild-type and engineered bacteria

3 討 論

乙醛酸的生物合成法是近年來研究的熱點。目前，生物法主要是通過酵母的靜息細胞進行生物催化反應，利用乙醇酸氧化酶將乙醇酸氧化為乙醛酸[29]，反應中需要以石油的衍生物乙醇酸作為底物，同時加入過氧化氫酶和黃素單核苷酸，此方法不僅操作復雜，而且生產成本高，嚴重限制了其產業化應用。與之相比基因工程菌發酵法更有利于可持續發展，但關于基因工程菌發酵法生產乙醛酸的報道卻很少。Yang Chao等[30]發現通過提高異檸檬酸裂合酶基因icl的活性，可以增加流向乙醛酸旁路代謝通量；Toyoda等[31]通過敲除乳酸脫氫酶基因lldh，阻斷了丙酮酸與乳酸的旁路代謝，使丙酮酸大量積累；Eikmanns等[32]發現，通過基因克隆敲除異檸檬酸脫氫酶基因icd后，α-酮戊二酸生成量大大減少，而乙醛酸含量增加，但是由于異檸檬酸脫氫酶是TCA循環的關鍵酶，阻斷后造成菌體生長受到較大影響。

為解決敲除必需基因后影響菌體生長的問題，本研究借助CRISPRi技術，能夠在不影響細胞生長的前提下，對目標產品的代謝途徑進行優化和調整。在CRISPRi體系中，sgRNA能否高效準確表達，也關乎其能否正確引導Cas9蛋白對目的基因進行靶向編輯，因此sgRNA組件中啟動子和終止子的選擇也至關重要。Cleto等[12]選用誘導型啟動子tac，構建了一系列sgRNA載體應用于C. glutamicum的CRISPRi體系，通過添加誘導劑IPTG誘導sgRNA表達；Liu Jiao等[33]選用C. glutamicum中組成型強啟動子cspB的人工合成衍生體p11F作為其sgRNA組件的啟動子，選用rrnB作為其sgRNA組件的終止子，并對其效率進行測試，發現脫靶率下降至（1.3±0.2）×10-2，并認為其更適合C. glutamicum的CRISPR/Cas9系統；Jiang Yu等[34]構建了C. glutamicum的CRISPR/Cpf1系統，選用人工合成的組成型啟動子j23119作為sgRNA組件的啟動子，選用rrnB作為其sgRNA組件的終止子，利用該系統對γ-谷氨酰激酶G149處進行密碼子飽和突變，使其減輕對L-脯氨酸的抑制作用。本研究sgRNA組件中所采用的啟動子sod、tuf和終止子rrnB是天然啟動子及終止子，由于其轉錄范圍較大，不能精確表達Cas9蛋白特定的識別序列，因而在CRISPR/Cas9系統中可能影響到Cas9蛋白的對目標位置的精準切割，影響到CRISPRi體系對目標基因的調控范圍和強度。但在本研究中，通過檢測工程菌發酵液，發現與野生菌相比乙醛酸得到了積累，由此可以推斷本研究所選用的天然啟動子及終止子能夠應用于CRISPRi調控體系。為進一步提高代謝產物的產量，選擇更為確切的人工合成啟動子作為CRISPRi體系中sgRNA的啟動子，是本實驗室未來工作的重點。

本研究敲除C. glutamicum支流代謝關鍵酶乳酸脫氫酶合成基因lldh，并建立CRISPRi調控體系，利用該體系下調異檸檬酸脫氫酶和蘋果酸合酶的表達，同時強化異檸檬酸裂合酶，使得工程菌與野生型相比較生長速度基本相同，在不影響生長的情況下，達到生物合成乙醛酸的目的，經檢測工程菌培養48 h后的發酵液中乙醛酸質量濃度為5 mg/mL。由此獲得的遺傳資源將為乙醛酸生物合成生產奠定基礎，此技術方法也為其他代謝工程產品研究提供借鑒。