不同品種金針菇特征揮發性物質的差異分析

王鶴潼，潘泓杉，王 朝，方東路，胡秋輝，馬 寧,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

金針菇（Flammulina filiformis）又名毛柄金錢菌，在自然界中廣泛分布，適合在世界各地區生長[1]。由于其味道鮮美且營養豐富，深受國內外消費者歡迎[2]。國內生產的金針菇目前有3大類：純白色、鏈體乳白色至淺黃色、金黃色至淺褐色[3]。金針菇品種繁多，并且各種新品種不斷研發栽培[4]。

由于金針菇的表觀形態可能會受到底物和環境因素的影響，因此通過形態鑒定區分品種較困難，缺乏系統的共識鑒定方法是金針菇育種者鑒定品種時所面臨的最主要問題之一。因不同品種金針菇的生長特性、出菇特性、商品性狀和生物轉化率不同，而風味物質也存在各自的差別和獨特之處。近年來，對于不同品種金針菇的特性分析較多，Palapala等[5]用新的分子生物學工具從基因角度分析不同品種金針菇的DNA。許峰等[6]通過SRAP引物分析了不同品種金針菇菌株之間的遺傳關系。王守現等[7]通過菌種生長速度、菌絲生長勢和生物轉化率篩選適宜北京地區栽培的白色金針菇品種。由于上述方法均費時費力，建立一種簡便快捷的鑒定方法為金針菇品種的選育及生產加工提供依據尤為重要。

頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）聯用技術是將GC的分離特性與MS相結合檢測樣品中揮發性物質[8]。SPME-GC-MS技術的方便快捷已廣泛用于各種食品和農產品的品種鑒定和質量分析，例如酒[9]、大米[10]、肉類產品[11]、蘑菇[12]、蔬菜水果[13]、煙草[14]和油脂[15]。該技術也曾用于食用菌品種的風味分析，陳萬超等[16]利用SPME-GC-MS對12 個品種香菇的揮發性風味成分進行分析，并同時采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）進行數據分析。電子鼻技術可以模擬生物嗅覺，曾被用于研究食用菌的風味[17]。但電子鼻不僅受環境影響，還易受到氣敏傳感器靈敏度等方面的限制，其檢測結果與期望值存在一定差距[18]，通常將其與其他技術結合使用。SPME-GC-MS可對揮發性成分的具體種類和含量進行定性定量分析，而電子鼻是分析樣品中揮發性物質整體對風味特征的貢獻，二者結合分析可以從宏觀和微觀上全面研究揮發性成分，該方法被證實能有效區分8 種商業蘑菇[19]，并且也可以對金針菇不同貯藏期的風味變化進行監測[20]。楊江等[21]通過GC-MS和電子鼻對襄陽地區臘腸進行香氣成分測定，并采用PCA同時分析二者數據；Cui Shaoqiong等[22]采用PCA分別對不同年份人參GC-MS揮發性物質數據結合電子鼻數據進行了研究，結果顯示多技術結合能更有效地區分樣品組。然而，聯用SPME-GC-MS和電子鼻鑒定金針菇品種的研究鮮見報道。

本研究采用SPME-GC-MS和電子鼻分析5 個品種金針菇揮發性物質，由定量分析、PCA、HCA探究不同品種金針菇揮發性物質差異，并通過SPME-GC-MS結合電子鼻進行PCA對比品種鑒定準確率，為不同品種金針菇的選育及后期的加工開發提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從四川省農業科學院獲得的川金3號、川金11號、川金54號（以下簡稱3號、11號、54號）3 個品種金針菇樣品，從江南生物科技公司獲得的L4、L7兩個品種金針菇樣品。共獲得5 個樣品組，測定前將樣品用液氮研磨。

正構烷烴（C7～C30）混和標準品 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C型GC-MS聯用儀 美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相萃取頭 美國Supelco公司；FOX3000型電子鼻 法國Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 金針菇風味化合物SPME-GC-MS檢測

按照Lauriezo等[23]的方法進行SPME-GC-MS分析。用液氮研磨后，準確地稱量2.0 g金針菇樣品于20 mL頂空瓶中。將DVB/CAR/PDMS型萃取頭在250 ℃活化20 min后，在60 ℃水浴中進行靜態吸附萃取40 min，將萃取頭放入GC進樣口解吸。

GC條件：DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min升至230 ℃保持2 min。載氣（He）流速為0.8 mL/min，分流比為1∶1。

MS條件：電子電離源；接口溫度、四極桿溫度和離子源溫度分別為250 、150 ℃和230 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z25～450。

以正構烷烴的實際測量值校正保留時間，SPME-GCMS測定結果通過NIST 98數據庫（NIST 08，華盛頓特區）進行檢索，取匹配度80%以上的揮發性成分；以2-氯苯甲醛為內標物對各化合物進行定量分析。

1.3.2 金針菇風味化合物電子鼻檢測

根據Yang Wenjian等[24]的方法進行電子鼻分析，并稍作修改。使用Alpha M.O.S.（法國）電子鼻系統測定金針菇樣品中的揮發性風味物質。用液氮研磨后，精確稱取2.0 g金針菇樣品于20 mL頂空瓶內。樣品測量流速150 mL/min，檢測時間120 s。電子鼻配備12 個不同的氣體傳感器：LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2

和PA/2，通過傳感器陣列響應和模式識別技術對揮發性氣體分子進行分析。

1.3.3 特征揮發性物質的評定

根據劉登勇等[25]的方法，利用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）評定各揮發性化合物對樣品總體氣味的貢獻，定義對樣品風味貢獻最大的組分：ROAVstan=100，則其他揮發性化合物的ROAV小于100，按下式計算[25]：

式中：Cri、Ti分別為各揮發性化合物的相對含量/%和氣味閾值/（μg/kg）；Crstan、Tstan分別為對樣品風味貢獻最大組分的相對含量/%和氣味閾值/（μg/kg）。

ROAV≥1的物質為該品種金針菇的特征揮發性物質；0.1≤ROAV＜1的物質對該品種金針菇整體風味有修飾作用，且ROAV越大說明該物質對該品種樣品總體風味貢獻越大[25]。

1.4 數據處理

采用IBM SPSS Stastics 23軟件對SPME-GC-MS數據進行HCA，每組實驗重復3 次，所得結果以表示。使用AlphaSoft V9.1及Origin 2018作雷達圖及PCA圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種金針菇揮發性物質的SPME-GC-MS分析

2.1.1 SPME-GC-MS的定量分析

如表1所示，5 個品種金針菇樣品中共檢測出53 種揮發性成分，3號、11號、54號、L4和L7分別檢測出21、29、21、12 種和18 種成分，其中醇類、醛類和芳香烴類占總含量的60%～95%，醇類和醛類化合物一般來自于脂質的氧化[26]，而芳香烴類化合物有獨特的香味，對食用菌風味有重要影響[27]。不同品種金針菇僅有2 種共有揮發性成分，分別為1-己醇和2-十一烷酮。研究表明1-己醇具有花香和清澈的香味[26,28]。2-十一烷酮是柑橘類油性調味成分，用于調味品行業或驅蟲劑[29]。每種金針菇都有3 種或3 種以上其他品種中不存在的化合物，3號、11號、54號、L4和L7中特有化合物數量分別為3、12、3、4 種和4 種。

表1 不同品種金針菇樣品中揮發性化合物的相對含量Table 1 Relative contents of volatile compounds in different F. filiformis cultivars

續表1

表2 不同品種金針菇樣品中揮發性成分及對應的ROAVTable 2 Volatile compounds and their ROAVs in different F. filiformis cultivars

如表2所示，辛醛、苯乙醛、壬醛、癸醛、2-十一烷酮、2-甲基丁酸甲酯、D-檸檬烯為3號金針菇的特征揮發性物質（ROAV≥1），香葉基丙酮對3號金針菇的整體風味起修飾作用（0.1≤ROAV＜1）；1-己醇、反式-2-庚烯醛、辛醛、反式-2-辛烯醛、壬醛、2-十一烷酮、香葉基丙酮、2-正戊基呋喃、D-檸檬烯為11號金針菇的特征揮發性物質（ROAV≥1），1-庚醇、1-辛醇對11號金針菇的整體風味起修飾作用（0.1≤ROAV＜1）；1-壬醇、辛醛、壬醛、癸醛、2-十一烷酮、D-檸檬烯為54號金針菇的特征揮發性物質（ROAV≥1），1-辛醇、反式-2-庚烯醛對54號金針菇的整體風味起修飾作用（0.1≤ROAV＜1）；1-壬醇、庚醛、辛醛、反式-2-辛烯醛、癸醛、2-十一烷酮、2-正戊基呋喃為L4金針菇的特征揮發性物質（ROAV≥1），1-己醇對L4金針菇的整體風味起修飾作用（0.1≤ROAV＜1）；反式-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、癸醛、2-十一烷酮為L7金針菇的特征揮發性物質（ROAV≥1），1-己醇、1-辛醇、反式-2-庚烯醛對L7金針菇的整體風味起修飾作用（0.1≤ROAV＜1）。

醇類化合物具有植物香氣，是金針菇中主要的風味化合物之一，通常閾值較高，而不飽和醇閾值偏低，并隨著碳鏈的延長，香氣也會隨之增加。5 種金針菇中共檢測出5 種醇類化合物，存在于4 個品種金針菇中的1 種，是1-辛醇，具有柑橘果香[30]，屬于八碳化合物，揮發性八碳化合物是大多數食用菌的主要揮發性成分[31]，這與大多數食用菌的揮發性成分研究結果一致[32]。1-庚醇和1-戊醇均只在11號金針菇中被檢測到，且1-庚醇也是這種金針菇的特征風味物質之一。

醛類化合物也是金針菇特征風味化合物之一，氣味濃烈，低、中和高碳位數的醛類分別具有刺激性氣味、油脂味和柑橘皮的香味[27]。5 種金針菇中共檢測出10 種醛類化合物，在4 種金針菇中被檢測到的有3 種，分別為己醛、辛醛和癸醛，其中辛醛屬于八碳化合物。己醛具有青草氣味，是L4和54號金針菇中占比最高的化合物，相對含量分別為50.45%和16.30%，Malheiro等[33]曾在一種野生蘑菇中檢測到高含量的己醛，可用于鑒定其品種。庚醛、苯乙醛和反,反-2,4-癸二烯醛分別是L4、3號和L7金針菇中特有化合物，庚醛具有強烈的油脂氣味[34]，苯乙醛具有濃郁玉簪花香氣味[35]，反,反-2,4-癸二烯醛具有強烈的雞油香氣[36]。

酸類化合物只在54號金針菇中被檢測到，棕櫚酸具有土壤氣味，可與醇類物質發生反應形成酯類[37]，酯類化合物一般具有水果香氣。5 種金針菇中共檢測出7 種酯類化合物。其中只有鄰苯二甲酸二異丁酯存在于2 種金針菇中，其他6 種化合物均屬于特有化合物。鄰苯二甲酸二異丁酯具有芳香氣味，裴斐[32]在雙孢蘑菇檢測到過這種物質。酮類化合物通過不飽和脂肪酸或微生物的氧化以及氨基酸降解生成，具有花果香氣[27]。5 種金針菇中共檢測出3 種酮類化合物，共有的1 種，為2-十一烷酮。烯酮類來源于脂質的氧化加熱，賦予金針菇似玫瑰葉的香氣[27]。

烷烴類化合物一般氣味閾值較高，對食用菌風味貢獻率較小。5 種金針菇中共檢測出6 種烷烴類化合物，特有化合物2 種，分別為壬烷和2,6,10,14-四甲基十六烷。芳香烴類化合物閾值較低，一般具有獨特的香氣，對食用菌風味貢獻率較高，是5 種金針菇中種類最多且含有最多特有化合物的香氣物質。雪松烯在3號金針菇中相對含量高達35.65%，該化合物曾作為主要風味物質在五味子揮發油[38]和芒果[39]中被檢測出來，且發現它在茼蒿中的揮發性烯烴化合物中含量最高[40]。

雜環類、呋喃類和單環單萜類屬于其他類化合物，5 種金針菇中共檢測出5 種其他類化合物，獨有化合物有2 種，分別為2-甲基-2-(1-甲基乙基)環氧乙烷和4,5,6,7-四氫-3,6-二甲基-苯并呋喃。甲氧基苯肟是一種含氮的雜環類，具有霉味和肉味[41]；氨基酸的美拉德反應、熱分解反應，以及硫胺素的降解都是呋喃化合物的來源[42]，一般具有肉香味[31]；D-檸檬烯是一種單環單萜，具有果香橙子味[43]。

2.1.2 SPME-GC-MS的PCA

為了顯示5 個品種金針菇樣品組中53 種揮發性成分的差異，使用PCA對SPME-GC-MS進行分析。如圖1所示，前2 個主要成分的貢獻率是85.15%；PC1占52.31%，PC2占32.84%。PC1和PC2都明確區分了不同品種，5 個樣本組相互之間很好地分開，說明不同品種金針菇間揮發性風味相互獨立，且這2 個主成分可代表樣品風味的主要特征。所有的揮發組分根據不同品種樣品組也同樣明顯地區分開，其中，54號金針菇樣品組與12 種化合物分布重疊，11號金針菇樣品組與4 種化合物分布重疊。而其他3 個品種樣品組雖然沒有與化合物重疊，但四周都有各自相關的化合物。然而還是有很多比較分散的化合物，處于不同品種之間。這表明盡管使用53 種揮發性化合物也可以將品種區分開，但是金針菇的揮發性風味物質較復雜，并且在不同品種中有許多相似的物質，因此僅用SPMEGC-MS判別不同品種金針菇風味較為局限。

圖1 不同品種金針菇樣品基于SPME-GC-MS的PCAFig. 1 PCA plot of different F. filiformis cultivars based on SPME-GC-MS data

2.1.3 SPME-GC-MS的HCA

為了進一步分析SPME-GC-MS對于不同品種金針菇揮發性風味成分區分情況，將SPME-GC-MS數據進行HCA，結果如圖2所示。從圖2可以看出，不同品種金針菇揮發性成分的聚類樹狀圖顯示出3 個主要類別。其中，11號、54號和L7的樣品被歸為一類，而L4和3號的樣本被分別歸為其余兩類。在第一大類中，11號和54號的樣品在最小距離水平上首先聚類，這說明二者的樣品揮發性成分相似度很高。隨著歐式距離的增加，L7的樣品也并入到這一類中。而當歐式距離增加至13時，L4與11號，54號和L7的樣品歸為一類。隨著歐式距離的繼續增大，當增至25時，三大類才歸為一類。這與2.1.2節結果一致。HCA差異主要由不同品種中各類化合物種類和含量不同造成。結合表1可知，由于醇類、醛類和芳香烴類物質占所檢測總物質的60%～95%，因此影響樣品聚類的主要因素是三者的相對含量。

圖2 不同品種金針菇樣品的HCAFig. 2 HCA of different cultivars of F. filiformi

2.2 不同品種金針菇揮發性物質的電子鼻分析

2.2.1 電子鼻的雷達指紋圖分析

圖3 不同品種金針菇樣品中揮發性化合物的雷達指紋圖Fig. 3 Radar fingerprint charts of volatile compounds in different F. filiformis cultivars

將電子鼻數據作雷達圖，如圖3所示，顯示12 個傳感器對5 個不同品種金針菇樣本組的響應。傳感器PA/2、T70/2、P40/1、P10/2、P10/1和T30/1對L7金針菇的揮發性氣味響應值最高；傳感器LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL和LY2/gCT對3號金針菇的揮發性氣味響應值較高；傳感器LY2/LG對5 種金針菇樣品的揮發性氣味響應值相似。3號和L4響應值的輪廓相似，表明兩者的香氣成分接近，但是PA/2、T70/2、T30/1對3號和L4品種的金針菇樣品響應值可以明顯區分這2 種金針菇。其余3 種金針菇樣品響應值的輪廓相似，說明這幾個品種的金針菇樣品的香氣成分接近，但是LY2/G、LY2/AA、LY2/GH、LY2/gCTL對11號、54號、L7品種的金針菇樣品響應值可以明顯區分這3 種金針菇。

2.2.2 電子鼻的PCA

圖4 不同品種金針菇樣品基于電子鼻的PCAFig. 4 PCA of different cultivars of F. filiformis based on E-nose data

將電子鼻數據作PCA，如圖4所示，累計貢獻率為99.87%，其中PC1占97.10%，PC2占2.77%。結果顯示，5 個品種金針菇被明顯地區分開。對比圖4與圖1，發現通過電子鼻PCA的數據集分布更類似于基于SPME-GC-MS的53 種揮發性化合物的分布，而電子鼻能將所有品種很好地區分且使其成團，說明電子鼻數據穩定性和重復性較好，可以輔助SPME-GC-MS數據分析不同品種金針菇揮發性物質。

3 結 論

通過SPME-GC-MS分析，5 個品種金針菇樣品中共檢測出53 種揮發性成分，3號、11號、54號、L4和L7分別檢測出21、29、21、12 種和18 種成分，其中，最主要的是醇類、醛類和芳香烴類。根據ROAV≥1確定各金針菇中特征揮發性物質，SPME-GC-MS可以有效區分不同品種，不同品種特征性揮發性物質種類和含量不同。電子鼻能將所有品種有效區分且使其成團，說明電子鼻數據穩定性和重復性較好，可以輔助SPME-GC-MS數據分析不同品種金針菇揮發性物質。因此，可使用SPME-GCMS技術結合電子鼻技術對金針菇不同品種的揮發性物質進行綜合分析和鑒別，為不同品種金針菇的選育及后期的加工開發提供一定參考依據。